اثر گليسرول در طي فرايند انجماد روي زنده ماندن اسپرم بز

مقدمه
غشاءها از اولین اهداف آسیب منجمد شدن و سرما زدگی در سلول می باشند. در طی فرایند سرد شدن یک استرس حرارتی بر روی غشاء ایجاد شده و منجر به تغییر کریستال مایع به فاز ژلی می شود که در نتیجه اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجه این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده و محتویات آن به مکان مجاور تراوش و منجر به آسیب دیدن دو لایه بین کریستال مایع و ژل بشود. علاوه بر آن، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشاء شود. بنابراین نگهداری سلامت غشاء برای تولید اسپرماتوزوا با کیفیت بعد از منجمد شدن بسیار اهمیت دارد(7).
مطالعات موجود در مورد چگونگی جلوگیری از ایجاد کریستالهای یخ درون سلولی و جلوگیری از شوک سرمایی، فصلی جدید در تحقیقات است که در دهه های اخیر مورد توجه قرار گرفته شده است(7،5 و13). هدف از اضافه کردن رقیق کننده ها تأمین انرژی مورد نیاز سلول های اسپرم، حفاظت سلول ها از آسیب های دمایی، کاهش استرس های فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن، انجماد و یخ گشایی سلول های اسپرم و در نهایت ایجاد یک محیط مناسب برای زنده ماندن موقت اسپرم ها است(17).
علیرغم سالها تحقیق در رابطه با انجماد اسپرم بز، نتایج ضعیف حاصل شده بیانگر وجود علل مختلف در این فرایند می باشند که می توان به تغییرات فصلی کیفیت منی، اثر منفی پلاسمای منی بر اسپرم، حساسیت کلاهک اسپرم و ایجاد کریستالهای یخ درون سلولی اشاره نمود. ذخیره منی تا اندازه ای در وضعیت انجماد، باعث آسیب های ساختمانی، بیوشیمیایی و اعمالی اسپرماتوزوا شده که تحرک و زنده مانی آن را کاهش داده و در نتیجه به انتقال و باروری اسپرم صدمه می زند.(6،5 و 7).
گلیسرول به عنوان محافظت کننده نفوذ پذیر به طور گسترده در انجماد اسپرم گونه های مختلف مورد استفاده قرار می گیرد. این ماده قابلیت نفوذپذیری بالایی داشته و اثر درون سلولی از خود نشان می دهد و در نتیجه با آبکشی اسپرم، تشکیل کریستال های یخ درون سلولی را به تعویق انداخته و یا حتی کاهش می دهدو در نتیجه صدمات ناشی از آن را به حداقل ممکن می رساند(16،15،14 و 19).
با این وجود، گزارشاتی نیز در ارتباط با اثرات منفی گلیسرول برای سلول اسپرم وجود دارد. که میزان گلیسرول، درجه حرارت درزمان اضافه کردن گلیسرول و نحوه اضافه کردن آن از عوامل تاثیر گذار محسوب می شوند(15).

اهمیت رقیق کننده های اسپرم در فرایند انجماد
نظر به اینکه اسپرم در زمان رقیق شدن و انجماد در محیطی قرار می گیرد که نسبت به شرایط طبیعی خود متغیر می باشد لذا بایستی ترکیبات رقیق کننده ها، اسپرم را نسبت به شرایط متغیر بوجود آمده حفاظت نموده و حتی الامکان دچار صدمات کمتری کنند. رقیق کننده های منی دارای یکسری خواص ویژه ای هستند که موجب نگهداری طولانی تر سلولهای اسپرم می شوند. یافتن رقیق کننده های مناسب برای رقیق سازی منی بز به منظور نگهداری بصورت مایع و منجمد ضروری می باشد (11 و 13). به نظر می رسد که بهترین رقیق کننده اسپرم بز، تریس، اسید سیتریک، فروکتوز، زرده تخم مرغ به همراه گلیسرول می باشد(1).
عمل آوری و انجماد اسپرم اکثر پستانداران مستلزم گذراندن دو مرحله می باشد. طی مرحله اول که دورة خنک کردن نامیده می شود دمای منی رقیق شده از دمای 35 - 30 درجه به 5 درجه سانتی گراد و در مرحله دوم که دوره منجمد کردن می باشد، دمای منی رقیق شده از 5 درجه به 196- در نیتروژن مایع کاهش داده می شود(1http://www.ardalan.id.ir/forum/image.../icon_cool.gif.
در مرحله اول برای مقابله با شوک سرمایی اسپرم ها معمولا از لیسیتین، پروتئین و لیپوپروتئین های زرده تخم مرغ استفاده می شود و به رقیق کننده که در ابتدای این دوره به منی اضافه می شود رقیق کننده سرمایی اطلاق می شود. در مرحله دوم به منظور حفاظت اسپرم در مقابل صدمات ناشی از تشکیل بلورهای یخ از گلیسرول به مقدار 7 – 3 % استفاده می شود و به رقیق کننده هایی که در آغاز این مرحله به مایع منی اضافه می گردد رقیق کننده انجمادی گفته می شود(3).
نقش گلیسرول در انجماد
گلیسرول بعنوان یکی از اجزای تشکیل دهندة ترکیبات رقیق کننده ها در سال 1949 برای اولین بار توسط پولژ مورد استفاده قرار گرفت و ویژگی باند شدن آن با آب بوسیلة مکسول و سالامون توضیح داده شد و بعد از آن استفاده از گلیسرول برای حفاظت از اسپرماتوزوا در فرایند انجماد رایج و متداول شد(15).

مطالعات جدید ثابت کردند که گلیسرول مهمترین و بیشترین تأثیر حفاظت کنندگی را برای انجماد منی پستانداران داشته، بطوریکه اضافه کردن ترکیبات دیگری هیچ برتری نسبت به آن ندارند بنابراین برای حفاظت از سلول اسپرماتوزوا گلیسرول رایج ترین و متداول ترین حفاظت کننده برای منی بز می باشد. اگرچه زمان مناسب اضافه کردن گلیسرول در طی انجماد هنوز بطور کامل مشخص نشده است(15).
گلیسرول قابلیت نفوذ پذیری بالایی داشته و اثر درون سلولی از خود نشان می دهد برای مثال اثر آبکشی شدید و بالای گلیسرول باعث کاهش تشکیل کریستال های یخ درون سلولی می شود. مکانیسمی که گلیسرول باعث آبکشی و کاهش دمای انجمادی می شود به پتانسیل بالای پیوند آبی آن مربوط می شود که درنتیجه غلظت الکترولیت های آزاد شده افزایش یافته و ساخته شدن کریستال های یخ به تأخیر افتاده و یا مقدار آن کاهش می یابد در نتیجه اسپرم در مقابل تغییرات فشار اسمزی و غلظت های نمک محافظت می شود(15 و 17).
گلیسرول اضافه شده به رقیق کننده مایع منی موجب تغییر در شکل گیری و اندازه بلورهای یخ می شود و آب سلول ها را گرفته و با یون های فلزی کمپلکس ایجاد می نماید وسپس به سرعت وارد اسپرم های زنده شده ومورد اکسیداسیون قرار می گیرد. (15 و 17).
اضافه کردن گلیسرول ممکن است بصورت تک مرحله ای، دو مرحله ای، سه مرحله ای و در دماهای 35،5 و 37 درجه سانتی گراد باشد غلظت نهایی محافظت کننده های انجمادی نفوذپذیر در رقیق کننده ها متغیر می باشد و از طریق سمیت و یا اثرات سودمندی اش بر روی اسپرم تعیین می شود( 4 و15).
عده ای از محققین اعتقاد دارند که باتوجه به ورود سریع گلیسرول به درون سلول، احتمالا اثر برون سلولی نیز می تواند داشته باشد. البته بایستی اشاره نمود که زمان تعادل و عادت پذیری اسپرم در رقیق کننده حاوی گلیسرول از یک ساعت تا چند ساعت متفاوت می باشد( 15،4 و 17).

محدودیت های استفاده از گلیسرول بعنوان حفاظت کننده
علیرغم اثرات سودمند گلیسرول روی اسپرماتوزآ در طی انجماد، مریمان (1966) ثابت کرد که گلیسرول می تواند اثرات زیان آوری در طی انجماد و یخ گشایی بر روی گلبولهای قرمز خون داشته باشد. گلیسرول لایه های غشاء را تغییر داده و با پروتئین ها و گلیکوپروتئین ها واکنش می دهد. گلیسرول همچنین احتیاجات فعالیت زیستی اسپرماتوزوا را افزایش می دهد، واکنش آکروزومی اسپرماتوزوا را تسریع می بخشد، علاوه براین مشخص شده است که گلیسرول باروری را در ماده ها زمانیکه از منی ذخیره شده در c ˚5 + استفاده می شود، کاهش می دهد. علی رغم گزارشات در مورد اثرات زیان آور گلیسرول، استفاده از گلیسرول بطور کلی فقط برای محافظت از منی طی انجماد توصیه می شود(4 و 15 ).
هرچند در منابع مختلف از گلیسرول بعنوان یکی از اجزای تشکیل دهنده بسیار مهم در رقیق کننده ها نام برده می شود اشاراتی در مورد نکات منفی آن نیز شده است. گفته می شود که گلیسرول روی آکروزوم اسپرم خاصیت سمی دارد و باعث کاهش باروری می شود. چگونگی تأثیر گذاری منفی گلیسرول به شکل های مختلف بیان شده است بعضی از محققین بر این باور هستند که گلیسرول می تواند آنزیم ATPase را مهار کرده و باعث اختلال در تعادل یونی شود و یا اینکه بر روی لیپیدهای غشاء سلول تأثیر گذاشته و باعث تغییر ساختمان آن می شود. درجه حرارت زمان اضافه نمودن، نحوه اضافه نمودن و میزان گلیسرول از عوامل تأثیر گذار اثرات منفی گلیسرول می باشد( 15).
کولاس (1975) در طی تحقیقی بیان نمودکه گلیسرول ممکن است کمی برای سلول اسپرماتوزآ سمی باشد و اثرات سمی آن را می توان با اضافه کردن آن در دمای نزدیک صفر کاهش داد. بر خلاف این پیشنهاد، سالامون (1986) و مکسول و سالامون (2000) گزارش کردند که رقیق شدن تک مرحله ای منی با رقیق کننده حاوی گلیسرول بهتر و موثر تر از روش دو مرحله ای می باشد(15).
اضافه کردن گلیسرول می تواند آسیب های اسمزی را به اسپرم القا کند اما وسعت این آسیب ها در گونه های مختلف متغیر است. اسپرم بز دارای این ویژگی می باشد که قادر است وضعیت های اسمزی را وقتی که در معرض گلیسرول قرار می گیرد تحمل کند(4 و 15).

مروری بر پژوهش های انجام شده
تولید اسپرم با کیفیت بالا از حیوانات باعث بهبود وضعیت حفاظت اسپرم در طولانی مدت می شود که این کار به حفظ ذخائر ژنتیکی در آینده کمک می کند و تضمین استفاده بهینه از نرهای ویژه می باشد. چنانچه ترکیبات رقیق کننده مناسب با ترکیبات اسپرم باشد امکان جمع آوری و ذخیرة اسپرم در خارج از فصل تولید مثل و همچنین انتقال اسپرم بصورت محلی و بین المللی امکان پذیر می باشد.(4)
کاندا و همکاران (2000) مشاهده کردند که درصد اسپرم های متحرک پس از یخ گشایی با استفاده از 6% از محافظت کننده های انجمادی نفوذپذیر گلیسرول، اتیلن گلیکول، دی متیل سولفوکساید، به ترتیب برابر35 % ، 13% و 21% بود. آنها همچنین گزارش نمودند که استفاده همزمان از گلیسرول (6%) و دی متیل سولفوکساید (9/5%) اثرات سینرژیسم روی حرکت پیشرونده اسپرم منجمد شده داشت (45%) در حالیکه استفاده جداگانه از گلیسرول و دی متیل سولفوکساید به ترتیب 33 و 15 % تحرک پس از یخ گشایی داشت.
کاندا و همکاران (2001) در طی یک پژوهش دیگر بیان کردندکه استفاده از اسیدهای آمینه همراه با 87/0 مولار گلیسرول و 76/0 مولار دی متیل سولفوکساید بطور معنی داری حرکت پیشرونده پس از یخ گشایی را بهبود می بخشد(55 – 50 %).
آموها و همکاران ( 1997) در طی پژوهشی بیان کردند که استفاده از 5% گلیسرول در رقیق کنندة بر پایة تریس جهت انجماد اسپرم بز بهتر از 4 – 3 % گلیسرول می باشد
سونماز و همکاران (2004) طی پژوهشی بر روی انجماد منی قوچ مشاهده کردند که استفاده از 5% گلیسرول می تواند تحرک پس از یخ گشایی را بالا برده و آسیب های آکروزومی و اسپرم های غیر طبیعی را کاهش دهد. اگرچه افزایش در سطوح گلیسرول (7 – 3 % ) بعد از گلیسروله شدن و تعادل سازی در رقیق کننده می تواند اثرات منفی روی ویژگی های اسپرم داشته باشد.
موریر و همکاران (2002) با انجام تحقیقی پیشنهاد دادند که استفاده از گلیسرول جهت حفاظت از اسپرم قوچ و سایر حیوانات در طی انجماد ضروری می باشد آنها همچنین نتیجه گرفتند که روش های اضافه کردن گلیسرول در انجماد اسپرم روی اسپرم یخ گشایی شده تأثیری ندارد.
پنا و همکاران (1998) از 4 غلظت مختلف گلیسرول در رقیق کنندة منی سگ در دمای 37 و 4 درجه استفاده کردند و گزارش نمودند که تحرک اسپرم و سلامتی آکروزوم هنگام استفاده از 8 % گلیسرول در رقیق کننده بطور معنی داری افزایش پیدا می کند.
سی همکاران (2004) نتیجه گرفتند که هنگام استفاده از 5 %گلیسرول تحرک اسپرم، سلامتی غشاء پلاسمایی و سلامتی آکروزوم اسپرم میمون بطور معنی داری پس از یخ گشایی بهبود می یابد. آنها همچنین به این نتیجه رسیدند که استفاده از 5 % گلیسرول بطور معنی داری پارامترهای اسپرم میمون را پس از یخ گشایی نسبت به استفاده از 5 % دی متیل سولفوکساید بهبود می بخشد نتایج این آزمایشات نشان داد که نوع و غلظت انجماد کننده های نفوذ پذیر می تواند بطور مؤثری روی بقای اسپرم میمون پس از انجماد و یخ گشایی تأثیر داشته باشد. آنها همچنین پیشنهاد نمودند که سطح مناسب گلیسرول برای انجماد اسپرم میمون 5 % می باشد و دی متیل سولفوکساید برای انجماد اسپرم میمون مناسب نمی باشد.
سیلوا و همکاران (2006) بین اضافه کردن گلیسرول در درجه حرارت های مختلف تفاوتی را مشاهده نکردند. آنها پیشنهاد دادند که اضافه کردن گلیسرول به رقیق کننده های انجمادی سگ در درجه حرارت های c ˚27 یا c ˚4 مناسب می باشد.
تولی و هولتز (1994) نیز با انجام تحقیقی روی بز نشان دادند که اضافه کردن گلیسرول بصورت چند مرحله ای و در 37 درجه سانی گراد بطور معنی داری تحرک پیشرونده را پس از یخ گشایی در مقایسه با اضافه کردن گلیسرول بصورت تک مرحله ای در 37 درجه یا رقیق کردن چند مرحله ای در 5 درجه سانتی گراد بهبود می بخشد.
جورج گیل و همکاران (2003) بیان نمودندکه استفاده از رقیق کننده های تجاری بهمراه گلیسرول می تواند تحرک اسپرم پس از یخ گشایی را بطور معنی داری بهبود ببخشد.آنها همچنین گزارش کردند که اضافه کردن گلیسرول در 15 درجه سانتی گراد در مقایسه با 5 درجه تأثیری روی شاخص تحرک نداشت اما تحرک و سلامتی غشاء اسپرم ها در 5 درجه نسبت به 15 درجه بالاتر بود.

نتیجه گیری
با توجه به پژوهش های صورت گرفته، گلیسرول مهمترین و بیشترین تأثیر حفاظت کنندگی را برای انجماد منی پستانداران داشته، بطوریکه اضافه کردن ترکیبات دیگری هیچ برتری نسبت به آن ندارند بنابراین برای حفاظت از سلول اسپرماتوزوا گلیسرول رایج ترین و متداول ترین حفاظت کننده برای منی بز می باشد، اگرچه زمان و درجه حرارت مناسب اضافه کردن گلیسرول در طی انجماد هنوز بطور کامل مشخص نشده است. لذا انجام تحقیقاتی در رابطه با تعیین زمان و درجه حرارت مناسب برای افزودن گلیسرول در فرایند انجماد ضروری به نظر می رسد، تا بتوان از سطوح بهینه گلیسرول با توجه به گونه دام در رقیق کننده ها استفاده نمود.

منابع:
1 - Amoah, E. A and Gelaye. 1997. Biotechnological advances in goat reproduction. J. Anim. Sci. 75: 578-585.
2- Barkawi, A. H., H. Eitedal, A. Ashour and E. shehata. 2005. Seasonal changes in semen charachteristics, hormonal profiles and testicular activity in Zaraibi goats. Small Rum. Res. …:1 – 5.
3- Bearden, H. J. & J. W., Fuquay 1985.Applied animal reproduction, Mississippi State University, 6ed. 440 pp
4- Biswas, D., F. Y. Bari., M. Shamsuddin., M. M. Rahman and M. M. rahman. 2002. Determination of Glycerol percentages for preserving the black Bengal buck (capra hircus) spermatozoa for long time. Pakistan Journal of. Bio. Sci. 5(6): 715-718.
5- Cabrera, F., F. Gonzalez., M. Batista., P. Calero., A. Medrano and A. Gracia. 2005. The effect of removal of seminal plasma, egg yolk level and season on sperm freezability of canary buck. Rep. Dom. Anim. 40(3):191-195.
6- Eiman, M-E. Aboagla and T. Terada. 2004. Effects of the supplementation of trehalose extender containing egg yolk with sodium dodecyl sulfate on the freezability of goat spermatozoa. Theriogenology. 62: 809-818.
7- Eiman, M-E. Aboagla and T. Terada. 2004. Effects of egg yolk during the freezing step of cryopreservation on the viability of goat spermatozoa. Theriogenology. 62: 1160-1172.
8- Eiman, M-E. Aboagla and T. Terada. 2003. Trehalose-Enhanced fluidity of the goat sperm membrane and its protection during freezing. Bio of Rep. 69: 1245-1250.
9- Fiser, P.S and R. W. Fairfull. 1989. The effectc of glycerol-related osmotic changes on post-thaw motility and acrosomal integrity of ram spermatozoa. Cryobiology. 26(1): 64-69.
10- Gil, J., N. Lundeheim and L. Soderquist. 2003. Influence of extender, temperature, and addition of glycerol on post-thaw sperm parameters in ram semen. Therigenology. 59:1241-1255.
11- Hafez, E. S. E. Reproduction in farm animal. Philadelphia, PA, 1987 5th Edition. P:315 – 317.
12- Holtz, W.2005.Recent developments in assisted reproduction in goat. . Small Rum. Res. 60:95-110.
13- Leboeuf, B., B. Restall and S. Salamon. 2000. Production and storage of goat semen for artificial insemination. Anim. Rep. Sci. 62: 113-141.
14- McGann, LE and ML. Walterson. 1987. Cryoprotection by dimethyl sulfoxide and dimethyl sulfone. Cryobiology. 24(1): 6-11
15- Morrier, A. F., Castonguay and J. L. Bailey. 2002. Glycerol addition and conservation of fresh and cryopreserved ram spermatozoa. Can. J. Anim. Sci. 82: 347-356.
16- Pena, A. I., F. Barrior. L.A. Quintela and P. G. Herradon. 1998. Effect of different glycerol treatments on frozen-thawed dog sperm longevity and acrosomal integrity. Therigenology. 50(1): 163-173.
17- Purdy, P. H. 2005. A review on goat sperm cryopreservation. Small Rum. Res. xxx-xxx.
18- Salisbury, G. W., N. L., Van Demark and J. R., Lodge. 1985. Physiology of reproduction and artificial insemination of cattle. CBS publishersanddistributors. 1st ed. 798 pp
19- Si, W., P. Zheng., Y. Li and A. Dinnyes. 2004. Effect of glycerol and dimethyl sulfoxide on cryopreservation of rhesus monkey sperm. J. AM. J Primatol. 62(4): 301-306.
20- Sonmez, M and E. Demirci. 2004. The effects of ascorbic acid on the freezability of ram semen diluent with extenders containing different proportion of glycerol. J. Vet. Anim. Sci.28: 893-899.
21- Tuli. R. K and W. Holtz.1994. effect of glycerolization procedure and removal of seminal plasma on post-thaw survival and got-release from Boer goat spermatozoa. Theriogenology. 42: 547-555.



منبع: سازمان دامپزشكي