میکروسکوپ وعملکرد آنها

[Sara12]

میکروسکوپ وعملکرد آنها




آشنایی با میکروسکوپ ها و طریق عملکرد شان


اولین میکروسکوپ فقط از یک لوله ساخته شده بود که در یک انتها صفحه یی داشت که جسم در آن قرار می گرفت و در انتهای دیگر آن ذره بینی نصب شده بود.



در قرن هجدهم با ساخت عدسی هایی که انحنای بیشتری داشتند و در نتیجه بزرگنمایی شان بیشتر بود و همچنین ترکیب چندین عدسی با یکدیگر، قدرت تفکیک میکروسکوپ ها زیاد شد.

اما با فرارسیدن قرن بیستم و ارائه نظریه های علمی جدید و فناوری های تازه، ابداع انواع دیگر

میکروسکوپ ها امکان پذیر شد.با استفاده از فناوری ها و روش های جدید به کار رفته در

میکروسکوپ های فلورسانس، درک فرآیندهای سلولی در مقیاس هایی که پیش از این تصورش را نمی کردیم، امکان پذیر شد.


این فناوری ها نه تنها باعث درک بهتر ما از فرآیندهای حیات شد، بلکه امکانات بی شماری را برای توسعه روش های درمانی جدید در حوزه هایی مانند درمان بیماری هایی مثل سرطان و بیماری های قلبی- عروقی و ایمن شناسی فراهم می آورد.با استفاده از چنین میکروسکوپ هایی دستیابی به قدرت تفکیک ۵۰-۲۰ نانومتر امکان پذیر می شود

[Sara12]

کارکرد میکروسکوپ های فلورسانس


بیشتر میکروسکوپ هایی که تاکنون ابداع شده اند، میکروسکوپ نوری بودند. میکروسکوپ های نوری میکروسکوپ هایی هستند که برای بررسی یک جسم، از پرتوهای نور استفاده می کنند و نور را به جسم موردنظر می تابانند.

با این همه میکروسکوپ نوری یک ضعف عمده دارد که محدودیت قدرت تفکیک آن است. به دلیل ماهیت موجی نور، موج های مختلف موجود در یک پرتو نور، با یکدیگر تداخل می کنند.

به همین دلیل، وقتی با استفاده از عدسی یک پرتو نور را متمرکز می کنیم، بسته به طول موج نور و زاویه یی که عدسی می تواند نور را جمع کند، یک نقطه نورانی به پهنای ۲۰۰ نانومتر در جهت های x و y و عمق ۵۰۰ نانومتر در راستای z تشکیل می شود.در دهه ۱۹۳۰ انواع میکروسکوپ های الکترونی ابداع شد.

هر چند این میکروسکوپ ها همچنان گران است، اما استفاده از آنها متداول شد. با ابداع میکروسکوپ های الکترونی (که از پرتوهای الکترون به جای پرتو نور استفاده می کند) قدرت تفکیک به شدت افزایش یافت، زیرا طول موج پرتوهای الکترون کمتر از طول موج فوتون است. فوتون «ذره» تشکیل دهنده نور است.

هر چند با ابداع میکروسکوپ های الکترونی دنیای کاملاً تازه یی از جزئیات به روی ما باز شد که پیش از آن مشاهده نکرده بودیم، اما استفاده از آن برای تصویربرداری از نمونه های زیستی چندان مناسب نیست.

برای آنکه بتوانیم نمونه یی را با استفاده از میکروسکوپ الکترونی مشاهده کنیم، باید نمونه ها را در خلأ و به دور از هوا نگهداری کرد.

علاوه بر این پیش از اینکه بتوان جسم را زیر میکروسکوپ تماشا کرد، باید با استفاده از روش هایی آن را آماده کرد، از جمله برش جسم به لایه های نازک با استفاده از فلزهایی مثل اورانیوم، سرب یا پوشاندن نمونه با انواع فلزهای رسانا. در هر مورد ماده زیستی شناختی مشاهده شده به وسیله میکروسکوپ الکترونی دیگر زنده نیست.

هر چند میکروسکوپ الکترونی در زیست شناسی و پزشکی کاربردهای فراوانی دارد، اما مطلوب آن است که بدون کشتن نمونه ها بتوانیم قدرت تفکیک را زیاد کنیم گرچه سلول های انسان ها و حیوانات به قدر کافی بزرگ است و می توان با استفاده از میکروسکوپ های نوری آنها را مشاهده کرد.

کارکرد سلول به سنتز و انتقال پروتئین هایی بستگی دارد که با یکدیگر بر هم کنش دارند یا به هم متصل می شوند تا کار ویژه یی را انجام دهند.

برای مثال واکنش های ایمنی شناختی بدن ما به توانایی سلول ها برای تولید پروتئین هایی بستگی دارد که می توانند با اجسام خارجی مقابله کنند. علاوه بر این مرگ سلول ها نیز به پروتئین ها مربوط می شود و ناتوانی سلول ها برای مرگ کنترل شده به سرطان منجر می شود.


با توجه به اینکه قدرت تفکیک میکروسکوپ های نوری معمولی حدود ۲۰۰ نانومتر است، نمی توان چگونگی برهم کنش پروتئین را دید و دریافت که آیا پروتئین ها اصولاً با یکدیگر برهم کنش دارند یا خیر، چگونه پروتئین ها به بخش های خاصی از سلول منتقل می شوند و چرا وجود آنها در این بخش خاص ضروری است. درک این مکانیسم ها در پژوهش های پزشکی و ابداع روش های درمانی جدید بسیار ضروری است.

[Sara12]

در ابتدای قرن بیستم پدیده فلورسانس در ساخت میکروسکوپ به کار گرفته شد. فلورسانس یکی از پدیده های مربوط به نورتابی(لومین سانس) است

. ما معمولاً وقتی جسمی را می بینیم که نور از آن جسم بازتاب می شود.

رنگ جسم نیز به این موضوع وابسته است که جسم چه طول موجی را بازتاب می کند. در پدیده فلورسانس مولکول یک فوتون(یک ذره نور) با طول موج خاص را جذب و سپس آن را با طول موج بلندتری منتشر می کند.فلورسانس یکی از روش های بسیار متداول در تصویربرداری بافت های زیست شناختی است.
مواد زیست شناختی معمولاً نور را به شدت متفرق می کنند و در نتیجه تماشای آن ورای سطح سلول دشوار است.

در پدیده فلورسانس معمولاً طول موج نور گسیل شده از طول موج نور تابیده شده بیشتر است، بنابراین نور متفرق شده از سطح سلول را می توان از نور تابیده شده به سلول تفکیک کرد. برای انجام این کار از آینه های دورنگی استفاده می کنند. این آینه ها نور تابیده شده را دوباره به نمونه برمی گردانند، اما نور فلورسانس از آن عبور می کند، در نتیجه تماشای ساختارهای درونی سلول امکان پذیر می شود.برخی مواد زیست شناختی به طور طبیعی فلورسنت هستند،
اما رنگ ها و پروتئین های فلورسنت فراوانی نیز وجود دارد که می توان از آنها برای رنگ آمیزی بخش های ویژه یک سلول مثل هسته استفاده کرد.
حتی می توان آنها را به پروتئین های خاص درون سلول متصل کرد، در نتیجه پیگیری حرکت آنها درون سلول امکان پذیر می شود.استفاده از رنگ ها و پروتئین های نور کلید زدنی فلورسنت که به تازگی کشف شده است،
کاربردهای بسیاری در تصویربرداری فلورسانس دارد. این مولکول ها می توانند دو حالت داشته باشند؛ یک حالت درخشان یا حالت فلورسنت و یک حالت تاریک یا غیرفلورسنت.کلیدزنی بین این دو حالت با تاباندن نور با دو طول موج متفاوت انجام می شود.

یکی از کاربردهای مولکول های نور کلیدزدنی ردیابی پروتئین ها است.

اگر مولکول های فلورسنت به پروتئین های خاص متصل شوند و یک بخش کوچک از آنها فعال شود، پیگیری جابه جایی پروتئین ها بسیار آسان تر از حالتی است که همه پروتئین های درون سلول نور را گسیل کنند. علاوه بر این لحظه دقیق فعال سازی را می توان کنترل کرد.

[Sara12]

قدرت تفکیک زیاد بدون کشتن نمونه

چگونه می توان بدون آنکه نمونه های زیست شناختی را از بین برد، میکروسکوپ هایی با قدرت تفکیک زیاد ساخت؟

از آنجایی که قدرت تفکیک یک میکروسکوپ به طول موج بستگی دارد، یک راه برای افزایش قدرت تفکیک کاهش دادن طول موج است.

با این همه هنگامی که از طیف نور مرئی به سمت طیف فرابنفش(UV) می رویم، نور برای سلول های زنده کشنده می شود.

حتی کم ضررترین نور UVA این قدرت را دارد که پیوندهای درون DNA را بشکند و باعث جهش شود و سلول را از انجام فعالیت های طبیعی آن بازدارد.

اما دانشمندان توانستند با استفاده از دو عدسی شیئی رودررو قدرت تفکیک در راستای Z (یعنی عمق) را افزایش دهند.

از آنجا که زاویه جمع آوری نور زیاد می شود دستیابی به قدرت تفکیک ۱۰۰ نانومتر امکان پذیر می شود. با این همه در این روش قدرت تفکیک فقط در یک راستا زیاد می شود.
علاوه بر این دشواری های فنی هم وجود دارد که از جمله آنها می توان به نگهداری شی ء موردنظر در راستای درست و صحیح اشاره کرد.مولکول های نور کلید زن می توانند تصویربرداری از نمونه های زنده در مقیاس نانومتر را امکان پذیر کنند.

اگر مولکول ها در نقطه کوچکی از نمونه در حالت روشن (on) باشد و یک پرتو دونات شکل (شیرینی حلقه یی) حوالی این نقطه در حالت خاموش(off) باشد نقطه موثری که از آن پرتو فلورسنت بازتابیده می شود، بسیار کوچک تر می شود.

در حقیقت با استفاده از میکروسکوپ های «کاهش نشر تحریک شده» (STED) دستیابی به قدرت تفکیک در مقیاس ده ها نانومتر امکان پذیر شده است.

در این روش از اصول تشریح شده استفاده می شود، هرچند تاکنون مشخص نشده که آیا این روش برای تصویربرداری از سلول های زنده مناسب است یا خیر.

اگر در این روش از پروتئین ها یا رنگ های نور کلید زدنی استفاده شود، به قدرت تفکیک بیشتری نیاز نیست.

روشی دیگر برای اسکن کردن یک نقطه در یک نمونه استفاده از روش پراش است که روی جسم تابانده می شود تا تابش فلورسنت در خط باریکی متمرکز شود. سپس الگو را می توان در کل نمونه اسکن کرد. هر چند در این روش برای ارائه نتیجه نهایی به تهیه چندین تصویر با قدرت تفکیک زیاد نیاز است، با این همه تهیه تصویر سریع تر از روش های پیشین است.

علاوه بر اینها یک روش دیگر برای تصویربرداری در مقیاس نانو با استفاده از رنگ ها و پروتئین های نور کلیدزدنی این است که در ابتدا همه مولکول های درون نمونه در حالت خاموش باشند.
سپس شدت فعال سازی را در حدی تنظیم کنیم که فقط چند مولکول روشن باشند.

با توجه به میزان درخشندگی مولکول ها می توان موقعیت مولکول ها را با دقت ده ها نانومتر محاسبه کرد.
پس از انجام تصویربرداری، مولکول ها خاموش می شوند و در ادامه این فرآیند مولکول های دیگر روشن می شوند. تصویر نهایی از ترکیب چندین تصویر تهیه می شود.

نقطه ضعف این روش آن است که با توجه به تصویربرداری تنها چند مولکول در هر مرحله به صدها تصویر نیاز داریم در نتیجه این روش بسیار کند است و مناسب تصویربرداری از نمونه های زیستی نیست.

هرچند این تکنیک های باتفکیک بسیار بالا هنوز به صورت تجاری در دسترس نیست، اما انتظار می رود این وضعیت تا چند سال آینده تغییر کند.