sara
09-23-2010, 12:01 PM
نانوذرات طلا
اندازه اين ذرات سه تا صد نانومتر بوده و به دليل اينکه روشهاي اندازه‌گيري متعددي همچون جذب نوري، فلورسانس، پخش رامان، نيروي مغناطيسي و جريان الکتريکي مي‌توانند براي تشخيص آنها به کار روند، نشانگرهاي خوبي در طراحي بيوحسگرها مي‌باشند. از اين ذرات در تشخيص DNA ، پروتئين، ميکروارگانيسم‌ها و غيره استفاده مي‌شود. تشخيص DNA با استفاده از نانوذرات طلا نسبت به سيستم‌هاي تشخيص ژنومي رايج ده برابر حساسيت و صدهزار برابر ويژگي بيشتري دارد.
2-1 . روش‌هايي که در آنها بازخواني، به روش نورسنجي (Optical) صورت مي‌گيرد
از خصوصيات نوري و دمايي پروبهاي نانوذرات طلاي جدا از هم و مجتمع، (aggregated) به عنوان يک روش تشخيص استفاده مي‌گردد. ميان‌کنشِ ويژه موجود در بين اوليگونوکلئوتيدهاي تثبيت شده (DNA Probe) روي نانوذرات طلا و DNA هدف (DNA target) باعث تجمع (assembly) نانوذرات طلا به شکل شبکه‌اي متصل به هم و در نتيجه تغيير رنگ مي‌شود. اين تغيير رنگ به‌واسطه خصوصيات پخش، ميان‌کنشِ بين پلاسمون‌هاي سطح ذره و تغيير فاصله بين نانوذرات طلا ايجاد مي‌گردد. اين تغيير رنگ نشان‌دهنده وجود مولکول هدف در نمونه بوده و به روش چشمي هم قابل مشاهده است. اين شبکه متشکل از تجمع نانوذرات به‌وسيله هيبريدشدن پروبهاي نانوذرات طلا با مولکول هدف، در درجه حرارت‌هاي مختلف، باعث ايجاد تغيير رنگ ناگهاني (sharp) مي‌شود که در شکل (1)، نمونه‌اي از آن مشاهده مي‌شود.
با انتقال مخلوطي از مجتمعات ايجاد شده بين DNA تثبيت شده، زنجيره مکمل آن و رشته‌هايي با درجات متفاوتي از تغيير توالي (نسبت به زنجيره مکمل) بر روي TLC در دماهاي مختلف، مي‌توان الگوي استانداردي براي ارزيابي ميزان هيبريد شدن در دماهاي مختلف به دست آورد. با استفاده از اين خصوصيات رنگ و دما مي‌توان به روشي براي تشخيص وجود جهش در DNA هدف موجود در نمونه مورد بررسي، پي برد. به عبارت ديگر از اين روش مي‌توان براي تشخيص SNPs و ديگر mismatchs استفاده کرد. شکل (2) چگونگي استفاده از اين روش را براي تشخيص جهش در DNA هدف، نشان مي‌دهد.
حساسيت تشخيص روشهاي رنگ‌سنجي با احياي نقره (Ag) به وسيله نانوذرات طلا افزايش مي‌يابد. روش روبش‌گري (Scannometry)، يک روش سنجش ساندويچي و شامل رشته DNA متصل به يک بستر
(يا DNA Chip)، يک توالي هدف و يک پروب نانوطلاست. اتصال مولکول‌هاي هدف و پروب نانوطلا به توالي متصل به بستر، يکسري لکه‌هاي خاکستري (gray spot) را ايجاد مي‌کند که ويژه مولکول هدف بوده و غلظت نمونه را نيز نشان مي‌دهد. شدت رنگ اين لکه‌ها با يک روبش‌گر (scanner) و يا حتي چشم غير مسلح، قابل تشخيص است. در صورت استفاده از نقره، با احياي آن روي نانوذرات طلا (شکل 3) ، مي‌توان حساسيت تشخيص را بالا برد. با استفاده از نانوذرات مختلف طلا (و در نتيجه رنگ‌هاي مختلف) تشخيص همزمان چندين مولكول هدف ميسر مي‌گردد. اين روش تشخيص مولکولي چهار برابر ويژگي بالاتر و صد برابرحساسيت بيشتر از روشهاي فلوريمتري رايج دارد.
يک مثال براي اين روش، بارکد زيستي (Bio-barcode) است. بارکد زيستي، يک توالي DNA ساختگي و انتخابي براي يک توالي DNA هدف است که از آن براي تشخيص DNA (شکل 4) يا پروتئين (شکل 5) در نمونه‌هاي بيولوژيک استفاده مي‌شود.
الف) تشخيص DNA
در اين روش ابتدا يک زنجيره DNA با توالي دلخواه (Bar- Code DNA) طراحي و رشته مکمل آن نيز ساخته و پس از فعال شدن، بر روي نانوذرات طلا نشانده مي‌شود. همچنين رشته DNA ديگري که مکمل بخشي از DNA هدف (آنچه قرار است در نمونه شناسايي شود) است، پس از فعال شدن بر روي نانوذره طلا تثبيت مي‌شود. سپس اجازه هيبريد شدن رشته بار -کد با DNA مکمل داده مي‌شود. از طرفي رشته سوم DNA که مکمل بخش ديگري از DNA هدف است، پس از فعال شدن بر روي ذرات مغناطيسي تثبيت مي‌شود. با قرار گرفتن اين دو ذره در محلول، اگر DNA هدف وجود داشته باشد، حتي در مقادير بسيار اندک، موجب اتصال اين دو ذره به يکديگر مي‌شود. در مرحله بعد با توجه به خاصيت مغناطيسي ذره دوم، مي‌توان آنها را از محلول جدا کرد و بعد با استفاده از عواملي (مثل ترکيبات دناتوره‌کننده) که دو رشته DNA را جدا مي‌کنند، DNA بار-کد را از مکمل آن جدا و شناسايي کرد. حتي مي‌توان از ترکيباتي مثل نقره که حساسيت تشخيص را بالا مي‌برند نيز استفاده کرد. به اين ترتيب مقادير بسيار اندک از يک توالي DNA بدون نياز به PCR قابل شناسايي و حتي اندازه‌گيري است.
ب) تشخيص يا اندازه‌گيري پروتئين با استفاده از Bar- Code DNA
در اين روش نيز همانند روش قبل، از يک توالي انتخابي و مکمل آن که بر روي نانوذرات طلا نشانده شده، استفاده مي‌شود. همچنين آنتي بادي پلي کلونال عليه پروتئين مورد اندازه‌گيري بر روي اين ذرات طلا تثبيت مي‌شود. اين آنتي‌بادي‌ها بر روي ذرات مغناطيسي نيز نشانده مي‌شود. حال با وارد کردن اين دو ذره در محلول حاوي پروتئين مورد نظر، پروتئين به آنتي‌بادي موجود در سطح هر دو ذره متصل شده و آنها را به يکديگر متصل مي‌کند. پس از شستشو و حذف ساير مواد، با توجه به خاصيت مغناطيسي ذره دوم، مي‌توان آن را از محلول جدا و همانند روش قبلي، پس از جدا کردن رشته DNA بار-کد از مکمل آن با استفاده از مواد دناتوره‌کننده DNA بار- کد را، که نمادي از حضور پروتئين مورد نظر در نمونه است شناسايي و انداره‌گيري کرد. به اين ترتيب مقادير بسيار اندک پروتئين در نمونه قابل شناسايي است.
آخرين بحث مربوط به بازخواني نوري نانوذرات طلا، ترکيب نانوذرات طلا با رنگ‌هاي رامان است که پخش رامان به وسيله نانوذرات طلا (SERS) را افزايش مي‌دهد و به افزايش سيگنال براي مولکول‌هاي جذب شده در سطوح زبر فلز، به ويژه نقره و طلا مربوط مي‌شود. اين افزايش سيگنال از طريق دو ساز و كار تقويت موضعي ميدان الکترومغناطيسي در الکترون آزاد فلز و اثر شيميايي روي مولکول جذب شده در سطح فلز به‌وسيله نانوذرات طلا صورت مي‌گيرد. محدوده تشخيص، در محدوده طيف رامان بوده و به‌صورت اثر انگشت‌هاي طيف رامان ظاهر مي‌گردند. رنگ‌هاي رامان به‌دليل باندهاي جذبي باريک، تهييج از سوي ليزر و محدوده طيف رامان، قادر به افزايش سيگنال تشخيص در محدوده طيف‌هاي رامان مي‌گردند. با اين روش محدوديت لکه‌هاي خاکستري حاصل از روش روبشي(Scanometric) بر طرف شده، استفاده همزمان از چندين رنگ رامان در تشخيص چند مولکول امكان‌پذير مي‌گردد. شکل (6) چگونگي کاربرد اين روش را با استفاده از نانوذرات طلا نشان مي‌دهد.
نانوذرات طلا همچنين به عنوان داربست (Scafold) و فرونشاننده‌هاي quenchers نشر فلورسانس در تشخيص همگن اسيدهاي نوکلئيک عمل مي‌کنند [1]. همان‌طور که در شکل (7) ملاحظه مي‌شود، قطعات اليگونوکلئوتيد به يک ترکيب داراي نشر فلورسانس (فلوروفور) متصل مي‌شوند. سپس اين رشته‌ها به نانوذرات طلا متصل مي‌گردند، به طوري که به‌صورت تک‌زنجيره به ذره طلا نزديک شده و نشر نداشته‌باشند. پس از اينکه اين ذره در محلول حاوي DNA هدف قرار گرفت، در صورت تشکيل هيبريد، دو ماده فلوروفور از يکديگر فاصله گرفته، نشر فلورسانس قابل مشاهده و آناليز مي‌شود.
2-2. تشخيص الکتريکي مولکول‌هاي زيستي با استفاده از نانوذرات طلا
يکي از روشهاي ساده شناسايي DNA هدف، تشخيص الکتريکي است (شکل (8) سمت راست) . در اين روش پروبهاي DNA روي صفحاتي با اندازه ميکرون (chip) در بين دو الکترود، تثبيت مي‌گردد. اين پروب‌ها طوري طراحي مي‌شود که مکمل نيمي از DNA هدف باشد. همچنين طراحي پروبهاي نانوطلا به گونه‌اي است که اليگونوکلئوتيد آن مکمل نيمي ديگر از DNA هدف باشد. هيبريد شدن DNA هدف با پروبهاي نانوطلا و پروب تثبيت‌شده بر روي سطح، باعث مي‌شود که نانوذرات طلا در حدفاصل بين دو الکترود قرار گيرند. با افزودن نقره، کمپلکس تشکيل شده بين دو الکترود، فلز نقره را به داخل کشيده و پلي بين دو الکترود ايجاد مي‌شود. از تغيير جريان حاصل مي‌توان براي تشخيص حضور DNA هدف، استفاده كرد. دقت اين روش در حد 500 فمتو است و از آن در سنجش‌هاي ايمني نيز استفاده مي‌گردد.
2-3. تشخيص مولکول‌هاي زيستي با استفاده از خواص الکتروشيميايي نانوذرات طلا
خاصيت احياکنندگي نانوذرات طلا باعث شده است که از آنها به عنوان نشان‌هاي الکتروشيميايي در تشخيص اسيد نوکلئيک استفاده گردد. هيبريد شدن DNA هدف روي الکترود تثبيت شده با پروبهاي نانوطلا يک موج اکسايش طلا در حدود 27/1 ولت ايجاد مي‌كند. تشخيص حضور يک جهش منفرد يا پلي‌مورفيسم تک بازي (SNP)، همچنين شناسايي بازهاي درگير، با استفاده از نوکلئوتيدهاي نشاندار با نانوذرات طلا امکان‌پذير مي‌گردد [1 و 5]. چگونگي انجام اين روش در شکل (8)- سمت چپ، نشان داده شده است. همان‌گونه که ملاحظه مي‌شود، ابتدا اليگونوکلئوتيد مکمل با DNA هدف بر سطح الکترود تثبيت مي‌شود. آن‌گاه محلول بيولوژيک حاوي DNA هدف به آن اضافه و هيبريد تشکيل مي‌شود. اگر نمونه حاوي DNA داراي حتي يک جهش نيز باشد، چون تشکيل پيوند هيدروژني در آن ناحيه صورت نمي‌گيرد، در ناحيه جهش، باز (ها) آزاد است. حال ، نانوذرات طلاي متصل به تک تک نوکلئوتيدها، مرحله به مرحله به اين نمونه ، افزوده مي‌شود. در صورت اتصال نوکلئوتيد متصل به نانوذره طلا به باز مکمل (که نشانگر وجود جهش در DNA هدف است) ، موج اکسايش طلا به طريق الکتروشيميايي قابل مشاهده و اندازه‌گيري است.
برهنه‌سازي الکتروشيميايي (Stripping voltametry)
يک پروتکل اندازه‌گيري الکتروشيميايي حساس است که در اندازه گيري آثار عناصر فلزي در مايعات زيستي (خون، ادرار، بزاق)، بافت‌ها (دندان و مو)، فراورده‌هاي غذايي (نوشابه‌ها وآب) و نمونه‌هاي زيستي (آب دريا و رودها) کاربرد دارد. آناليزهاي بر پايه برهنه‌سازي الکتروشيميايي از دو مرحله پيش‌تغليظ، سپس برهنه‌سازي تشکيل شده است. در مرحله پيش‌تغليظ، نمونه محلول در حجم کوچکي از الکترود قرار مي گيرد که در حقيقت براي بررسي محلول‌هاي tracer به کار مي‌رود. در محلول پيش‌تغليظ Electrodeposition انجام مي‌شود که آناليت با انجام واکنش از محلول به داخل الکترود تغليظ مي‌شود و پس از اين مرحله، مرحله برهنه‌سازي با استفاده از روش ولتامتري انجام مي‌شود که طي آن آناليت تغليظ شده با انجام واکنش عکس مجدداً حل و اندازه‌گيري مي‌شود. به‌دليل تغليظ نمونه با فاکتور صد تا هزار برابر در الکترود، جريان اندازه‌گيري شده کمتر تحت تأثير جريان خازني يا جريان باقي‌مانده ناخالصي قرار مي‌گيرد. تقويت سيگنال، با استفاده از سوارکردن چندين نانوذره طلا، سپس نانوذرات نقره بر روي يک بستر پليمري به دست مي‌آيد. نانوذرات بعداً مي‌توانند به طور آنزيمي حل و به‌وسيله برهنه‌سازي الکتروشيميايي اندازه‌گيري شوند. از اين روش در تشخيص پروتئين و DNA استفاده مي‌گردد. شکل (9) تشخيص آنتي‌ژن با استفاده از روش برهنه‌سازي الکتروشيميايي را نشان مي‌دهد. در اين شکل ابتدا يک آنتي‌بادي پيگردي روي يک ذره مغناطيسي قرار مي‌گيرد که به آنتي‌ژن هدف مي‌چسبد. آنتي بادي تشخيصي که روي نانوذره طلا سوار شده است اضافه مي‌شود، سپس نانوذره نقره افزوده مي‌شود. نانوذره طلا باعث احياي نانوذره نقره مي‌گردد. کمپلکس نانوذرات و Ag-Ab روي يک مگنت قرار گرفته و نانوذرات روي الکترودها تغليظ مي‌شوند. با اعمال پتانسيل، نانوذرات رسوب‌کرده جدا شده و به روش برهنه‌سازي الکتروشيميايي تشخيص و اندازه‌گيري مي‌شوند که تغيير جريان با غلظت نمونه برابر است.
3. نقاط يا ذرات کوانتومي
نانوکريستال‌هاي مواد نيمه‌رسانا از قبيل سلنيد و کادميم، نانوابزار ديگري براي تشخيص آزمايشگاهي محسوب مي‌شود. اين کريستال‌هاي نيمه‌رسانا به عنوان منابع نور مولکولي عمل مي‌کنند و خصوصيات آنها به اندازه و شکل شان وابسته است. به محض اتصال يک آنتي‌بادي يا ديگر مواد تثبيت‌شده روي ذرات کوانتومي به مولکول هدف مورد نظر، نقاط کوانتومي شبيه beacon در اثر عمل اتصال، نور ساطع مي‌کنند. امروزه ذرات کوانتومي به دلايلي از قبيل نشر وابسته به اندازه ذره، درخشان‌تر بودن، تجزيه نشدن در برابر نور، تهييج همزمان چندين رنگ، تهييج ساده و حساسيت بالا مورد توجه قرار گرفته‌اند.
3-1. توليد پروبهاي نقاط کوانتومي
سنتز: اين نقاط يا ذرات عمدتاً از صدها تا هزاران اتم عناصر گروه دو و شش جدول تناوبي (مثل CdTe وCdSe) و يا عناصر گروه سه و پنج (مثل InP و InAs) به‌صورت دوفازي يا سه‌فازي تهيه مي‌گردند که اين سيستم دوعنصري موجب ايجاد حالت نيمه‌رسانايي اين ترکيبات مي‌شود. ذرات کوانتومي از يک هسته (core) نيمه‌رساناي فلورسانس (مثل CdSe، CdTe، InP و يا InAs) و يک پوسته ظريف از يک ماده با باند انرژي بيشتر (مثل CdS، ZnS و يا ZnSe) تشکيل شده‌اند. اين پوسته باعث پايداري هسته در برابر نور شده، از خاموشي سطحي تهييجات جلوگيري مي‌کند و در نتيجه بازدهي کوانتوم را افزايش مي‌دهد [10 و 11]. حلال‌هاي آلي از قبيل تري- ان- اكتيل فسفين (TOPO ) و هيدروکسيل آمين جهت حفظ خصوصيات نوري ذرات کوانتومي و محافظت هسته از محيط اطراف به عنوان پوشش (cap) به کار مي‌روند. ترکيباتي مثل پلي‌اتيلن گليکول (PEG) يا گروه‌هاي کربوکسيلات باعث حل‌شوندگي اين ترکيبات مي‌گردند. مرحله آخر توليد اين ذرات، مزدوج کردن (کنژوگاسيون) آنها به ليگاندهاي بيولوژيک از قبيل پپتيدها و اوليگونوکلئوتيدها براي اتصال به ترکيبات هدف است که اين کنژوگاسيون مي‌تواند به اشکال مختلف از جمله اتصال کوالاني، اتصال قطعه آنتي‌بادي به ذرات کوانتومي از طريق آمين سولفيدريل، کنژوگاسيون آنتي‌بادي‌ها به ذرات کوانتومي از طريق پروتئين آداپتور و اتصال پپتيدهاي منتهي به هيستيدين و پروتئين‌ها به ذرات کوانتومي حاوي Ni-NTA باشد. شکل (10) ساختمان پروب ذرات کوانتومي و شکل (11) روشهاي مختلف کنژوگاسيون ذرات کوانتومي را نشان مي‌دهد.
لازم به توضيح است که ذرات کوانتومي زماني نور را جذب مي‌کنند که انرژي برانگيختن بيشتر ازانرژي Bandgap باشد. در طول اين فرايند الکترون‌ها از لايه ظرفيت به لايه هدايت منتقل مي‌شوند. نشر وابسته به ذرات کوانتومي به شيوه on-off عمل مي‌کند که وابسته به قدرت برانگيختگي است و اين پديده احتمالاً از فوتويونيزاسيون و خنثي شدن بار نانوکريستال‌ها ناشي مي‌شود.
نانوذرات کوانتومي به دلايل مذكور کاربردهاي وسيعي پيدا کرده‌اند که از جمله اين کاربردها مي‌توان به موارد زير اشاره کرد[3]: Immunohistochemistry، تشخيص و تعيين ژنومي، تشخيص مارکرهاي زيستي، تشخيص اوليه سرطان، تشخيص ميکروارگانيسم‌هاي عفوني مثل مالاريا و HIV، سنجش‌هاي خون کامل، تشخيص حساس RNA ويروسي در حد صد کپي، سنجش‌هاي ايمني و تصويرسازي از بافت زنده و... .
3-2. تشخيص نوري مولکول‌ها به سيله ذرات کوانتومي
ذرات کوانتومي به‌دليل داشتن ضريب جذب مولي بالا بسيار درخشان‌تر از ساير مولکول‌هاي فلوروفور هستند، همچنين به‌دليل داشتن پايداري بيشتر در مقابل نور، طيف جذبي وسيع و نشري باريک، کانديداي خوبي جهت تشخيص مولکول‌ها در شرايط in vivo محسوب مي‌شوند. از اين خصوصيات نوري ذرات کوانتومي در شرايط in vivo براي تشخيص گيرنده‌هاي سطح سلولي، اجزاي اسکلت سلولي و آنتي‌ژن‌هاي هسته‌اي در نمونه‌هاي مختلف شامل سلول‌هاي زنده، سلول‌هاي تثبيت‌شده و برش‌هاي بافتي استفاده مي‌شود[1و3 و10و11و12]. شکل (12) تشخيص همزمان چندين مولکول هدف را به وسيله ذرات کوانتومي با اندازه‌هاي مختلف و در نتيجه با رنگ‌هاي مختلف و فلورسنت نشان مي‌دهد.
3-3.تشخيص مولکولي بر پايه خصوصيات الکتروشيميايي ذرات کوانتومي
ذرات کوانتومي داراي خصوصيات احياکنندگي هستند. از ذرات کوانتومي با پتانسيل‌هاي اکسيداسيون مختلف جهت تشخيص همزمان چندين مولکول هدف استفاده مي‌گردد (شکل (13)).
4. نانوذرات مغناطيسي
پروبهاي نانوذرات مغناطيسي يک کلاس جديد از عوامل کنتراست و پيگردي (tracking) جهت تصويرسازي پزشکي هستند. ساختمان اين ذرات شامل يک هسته (حاوي ترکيباتي مثل اكسيد آهن اَبَرپارامغناطيس (SPIO)، نيکل و يا کبالت) بوده که امروزه بيشتر از SPIOs به‌دليل نداشتن خاصيت سمي استفاده مي‌شود. در ساختمان اين نانوذرات پوششي (coating) از دکستران يا پلي اتيلن گليکول نيز وجود دارد که از تجمع (aggregation) اين نانوذرات جلوگيري و باعث حل شوندگي آنها در آب و آماده شدنشان براي کونژوگه شدن مي‌شود. نانوذرات با SPIOs، بنا به دلايلي از جمله غير سمي بودن، نداشتن خاصيت ايمني، اندازه کوچک، خاصيت مغناطيسي بالا، قابليت تنظيم براي ارگان‌هاي هدف ويژه با تغيير در اندازه، ضخامت پوسته، شيمي سطحي و ليگاند هدف بيشتر استفاده مي‌شوند. در کاربردهاي in vivo نانوذرات آهن اکسيد مگميت و مگنيت به عنوان عوامل کنتراست در تصويرسازي‌هاي MRI و NMR استفاده مي‌شود اين ترکيبات تصوير حاصل از MRI و NMR بافت هدف را در نتيجه به هم زدنRelaxation Time آب اطراف تيره‌تر از ساير قسمت‌ها مي‌کنند و در شرايط in vivo بافت‌هايي مثل کبد، طحال، مغز استخوان و گره‌هاي لنفاوي که حاوي ماکروفاژ بيشتري هستند عوامل کنتراست مغناطيسي را بيشتر به دام مي‌اندازند و از اين خاصيت در داخل بدن براي پيگيري بيماري‌هاي اين اعضا، به‌خصوص موارد التهابي به‌صورت فرايندهاي فيزيولوژيک استفاده مي‌کنند. چون در بافت‌هاي سرطاني، اين فرايندهاي فيزيولوژيک ماکروفاژها را جذب نمي‌کنند پس در NMR رنگ درخشانتري را نشان مي‌دهند. به منظور افزايش ويژگي پروبهاي نانوذرات مغناطيسي به بافت هدف، ليگاندهاي خاص مولکول يا بافت هدف همراه با يکسري عوامل در سطحشان که به آنها اجازه عبور از سلولها را مي‌دهند طراحي مي‌گردند. شکل (14) تصويري از پروب SPIOs را جهت تصويرسازي ويژه به وسيله MRI نشان مي‌دهد. از نانوذرات مغناطيسي در ايمنواسي‌ها نيز استفاده مي‌شود.
Magnetorelaxometry، روشي است براي سنجش که ويسکوزيسته مغناطيسي يا Relaxation حرکت مغناطيسي يک سيستم نانوذره مغناطيسي را پس از خاموش کردن ميدان مغناطيسي اندازه‌گيري مي‌کند. در اين سنجش‌ها آنتي‌ژن‌هاي هدف در سوسپانسيوني از آنتي‌بادي نشاندار با مگنت مخلوط مي‌گردند و با اعمال يک ميدان مغناطيسي، ذرات نانو خاصيت مغناطيسي خالص پيدا کرده که با خاموش کردن ميدان مغناطيسي،Relaxation پيدا مي‌کنند. تشخيص اتصال پروب به مولکول هدف با استفاده از تمايز فرايندهايRelaxation به دست مي‌آيد؛ نانوذرات غير متصل سريعاً چرخش براوني ( Brawnian) پيدا مي‌کنند، در حالي که نانوذرات متصل به مولکول هدف به آهستگي دچار Relaxation Neel شده و يک حرکت مغناطيسي ايجاد مي‌نمايند که آشکارساز (Dtector) آن را ثبت مي‌گردد. اين روش علاوه بر امكان‌پذير ساختن توانايي تشخيص و تمايز نشانگرهاي متصل و غير متصل به مولکول هدف نياز به جداسازي نمونه را نيز بر طرف ساخته و در نتيجه اجازه تشخيص همگن ماده را مي‌دهد.
5. نانوذرات سيليکا
نانو ذرات سيليکا؛ ذرات رنگي در اندازه‌هاي دو تا 200 نانومتر هستند و ساختمانشان از تشكيل تعداد زيادي مولکول‌هاي رنگي در داخل يک ماتريکس سيليکا است. سيگنال فلورسانس اين ذرات ده هزار بار قوي‌تر از فلوروفورهاي معدني است و به خاطر نشر و درخشندگي زيادي كه دارند کانديداي خوبي براي آناليزهاي حساس به شمار مي‌روند؛ به طوري‌که نياز به آمپلي فيکاسيون قبلي نمونه را بر طرف مي کنند. نانوذرات سيليکا علاوه برآناليزهاي حساس، در تصويرسازي مولکولي و تشخيص همزمان چندين مولکول هدف با استفاده از مولکول‌هاي رنگي با اندازه‌هاي مختلف (و در نتيجه رنگ‌هاي مختلف) كاربرد دارند. پايداري و چگالي بالاي سيليکا ، جداسازي سانتريفوژي، تغييرات سطحي و ديگر فرايندهاي آناليز را راحت‌تر کرده است. از مزاياي ديگر اين ذرات، هيدروفوبيک بودن ساختمان آنهاست که باعث محافظت از حمله‌هاي ميکروبي، تورم و يا تغيير منافذ آنها در اثر تغيير pH مي شود. از خاصيت فلورسنتي بالاي نانوسيليکا براي تشخيص ميکروارگانيسم‌ها و همچنين DNA و پروتئين در زمان سريع با حساسيت بالا استفاده مي‌گردد. اين ذرات به‌دليل داشتن مولکول‌هاي رنگي بيشتر در داخل ماتريکس سيليکا، سيگنال هيبريد خيلي قوي نسبت به نانوذرات قبلي مورد اشاره شده ايجاد مي‌کنند.
با استفاده از انواع مختلف رنگ‌هاي داخل ماتريکس كه داراي غلظت‌هاي مختلف هستند، مي‌توان نانوذرات بارکدينگ Substrate) -Barcoding) ايجاد کرد که مشخصات نوري ويژه‌اي دارند، اين نانوذرات قادر به شناسايي همزمان چندين مولکول زيستي را روي سطح سلول هدف هستند.
در شکل (15) از سيستم دورنگي استفاده گرديده‌است نانوذرات و آنتي‌بادي كه با نسبت‌هاي مختلفي كه دارند، به طور ويژه ميکروسفرهاي پوشيده با آنتي بادي ثانويه مربوطه را تشخيص مي‌دهند، در نتيجه به طور همزمان فرايندهاي تشخيص بين نانوذرات گنژوگه و مولکول‌هاي هدف مربوطه روي سطح سلول انجام مي‌شود. وقتي که مخلوط نانوذرات- سلول از يک فلوسايتومتر عبور داده مي‌شود هر کمپلکس نانوذرات- سلول فلورسانس ويژه‌اي را ايجاد مي‌کند که مشخصه نانوذرات متصل شده و در نتيجه نمونه به خصوصي در ايجاد يک موجي ويژه محسوب مي‌شود. از نانوذرات سيليکا به‌دليل داشتن خاصيت احياکنندگي زيادشان به عنوان نشان‌هاي الکتروشيميايي نيز استفاده مي‌شود.
6. نتيجه‌گيري
1. ذرات نانو به عنوان Labels يا Tags، حساسيت، سرعت و انعطاف‌پذيري تست‌هاي بيولوژيکي که حضور يا فعاليت مواد مورد نظر را اندازه مي‌گيرند افزايش مي‌دهد.
2. نانوذرات قادر به آزمايش نمونه‌هاي در حجم کم هستند.
3. از بسياري از روشهاي توصيف شده مي‌توان براي DNA و پروتئين‌ها استفاده كرد.
4. نانوذرات امکان تشخيص ميکروارگانيسم‌ها يا مولکول‌هايي که به وسيله روشهاي رايج امکان‌پذير نيست فراهم مي‌سازند.
5. تشخيص اوليه بيماري‌هايي از قبيل سرطان، بهبود و موفقيت درمان را بيشتر مي‌کند.
6. برخي از روشهاي اشاره شده نياز نمونه به PCR را برطرف مي‌کنند.
7. نانوذرات با کاهش زمان مورد نياز براي تست نمونه يک اثر مثبت روي تصميم‌گيري‌هاي باليني و هزينه‌هاي درمان دارند.
8. پروبهاي نانوذرات امکان کاربري در تشخيص‌هاي in vivo را به‌خوبي دارا هستند.
9. اکثر اين ترکيبات غير سمي يا سميتشان خيلي پايين است.
منابع
1-Natalia, C. T. and Zhiqiang, G. (2006) “Nanoparticles in biomolecular detection” Nanotoday ; 1 (1) : 28-37
2-Salata, O. V. (2004) “Application of nanoparticles in biology and medicine” J. Nanobiotechnology; 2 (3) : 1-8
3-Kewal, K. and Jain, T. (2005) ” Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics” Clinica Chimica Acta; 358: 37–54
4-Paolo, F. , Larry, J. and Saul, S. (2005) “Nanobiotechnology: the promise and reality of new approaches to molecular recognition” Trends in biotechnology ; 23 (4) : 169-173
5- Shad, C. and Mirkin, C. A. (2005) “DNA-Gold-Nanoparticles Conjugates” In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) ,WILEY-VCH. pp. 289-307
6- Shad, T. C. , Dimitra, G. and Mirkin, C. A. (2005) “Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acid targets” Clinica Chimica Acta. xx (2005) *** – ***
7-Jwa, M. N. , Shad, C. and Chad, C. M. (2003) “Nanoparticle-Based Bio-barcodes for the Ultrasensitive Detecetion of proteins” Science ; 301: 1884-1886
8- Jwa, M. N. , Savka. I. S. and Chad A. M (2004) “Bio-Bar-Code-Based DNA Detection with PCR-like Sensitivity” J. Am. Chem. Soc ; 126 (19) : 5932 -3
9-Park,S. J. and Chad, C. M. (2002) “Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle probes” Science ; 295: 15031506
10- Xiaohu, G. , Yang, L. , John A P. and Marshall, F. (2005) “In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots” Current |Opinion in Biotechnology ;16: 63-72
11- Xiaoho,G. and Shuming,N. (2005) “Luminescent Quantum Dots for biological Labeling” In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) , WILEY-VCH. pp. 343-341
12-Wu X, L. H. , and Liu, J. (2003) “Immunofluorescent labeling of
cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor
quantum dots” Nat. Biotechnol. ;21: 41– 6.
13-Pedro,T. , Maria, D. and Morale, P. (2003) “The preparation of magnetic nanoparticles for application in biomedicine” J. Phys. Appl. Phys;36: R182-R197
14- Conte,L. , Nitin ,N. and Gang, B. (2005) “ Magnetic nanoparticle probes” Nanotoday ;may 2005: 32-38
15-E. Romanus, M. , Hückel, C. and Weitschies, R. (2003) “Magnetic nanoparticle relaxation measurement as a binding specific technique for in vivo diagnostics” file: //F: \nnn\Nanoparticle Symposium May 2003- Abstracts.
16- Wang,L. , Kemin, W. , Swadeshmukul, S. ,Xiaojun, Z. Yanrong, W. (2006) “Watching Silica Nanoparticles” Anal. Chem ;February 1: 646-654
17- Zhao, X. , Lisa R. Hilliard*, Mechery,S. J. , Wang ,Y. ,Rahul, P. and Jin, Sh. (2004) “ A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation
using bioconjugated nanoparticles” PNAS;101 (42) : 15027-15032etic
http://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-1_resize.JPGشکل1. خصوصيات نوري نانوذرات طلاي جدا از هم و مجتمعhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-2_resize.JPGشکل2. تشخيص SNPs با استفاده از پروبهاي نانوطلا-DNAhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-3_resize.JPGشکل3. سنجش DNA به روش روبش‌گري(Scannometry) http://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-4.JPGشکل4. تشخيص DNA بر پايه Bio-Barcodehttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-5_resize.JPGشکل 5. تشخيص پروتئين (PSA) در مايع مغزي– نخاعي، بر پايه Bio-Barcodehttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-6_resize.JPGشکل6. تشخيص همزمان چند مولکول با استفاده از چند رنگ رامان و نانوذرات طلاhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-7_resize.JPGشکل7. تشخيص نوري مولکول‌ها با نانوذرات طلا به عنوان فرونشاننده‌هاي نشر فلورسانسhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-8.JPGhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-8-2.JPGشکل8. (سمت راست) تشخيص الکتريکي هيبريد شدن DNA و سمت چپ شناسايي الکتروشيميايي پلي‌مورفيسم تک بازي (SNP) با استفاده از نانوذرات طلاhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-9_resize.JPGشکل9. تشخيص يک آنتي‌ژن به روش برهنه‌سازي الکتروشيميايي با استفاده از نانوذرات طلاhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-10_resize.JPGشکل 10. ساختمان پروپ نانوذرات کوانتوميhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-11.JPGشکل11. روشهاي مختلف کنژوگاسيون ذرات کوانتوميhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-12_resize.JPGشکل12. تشخيص کمپلکس آنتي‌بادي‌ها با استفاده از ذزات کوانتوميhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-13.JPGشکل13. تشخيص الکتروشيميايي چندين مولکول هدف با استفاده از نانوذرات کوانتومي
اندازه اين ذرات سه تا صد نانومتر بوده و به دليل اينکه روشهاي اندازه‌گيري متعددي همچون جذب نوري، فلورسانس، پخش رامان، نيروي مغناطيسي و جريان الکتريکي مي‌توانند براي تشخيص آنها به کار روند، نشانگرهاي خوبي در طراحي بيوحسگرها مي‌باشند. از اين ذرات در تشخيص DNA ، پروتئين، ميکروارگانيسم‌ها و غيره استفاده مي‌شود. تشخيص DNA با استفاده از نانوذرات طلا نسبت به سيستم‌هاي تشخيص ژنومي رايج ده برابر حساسيت و صدهزار برابر ويژگي بيشتري دارد.
2-1 . روش‌هايي که در آنها بازخواني، به روش نورسنجي (Optical) صورت مي‌گيرد
از خصوصيات نوري و دمايي پروبهاي نانوذرات طلاي جدا از هم و مجتمع، (aggregated) به عنوان يک روش تشخيص استفاده مي‌گردد. ميان‌کنشِ ويژه موجود در بين اوليگونوکلئوتيدهاي تثبيت شده (DNA Probe) روي نانوذرات طلا و DNA هدف (DNA target) باعث تجمع (assembly) نانوذرات طلا به شکل شبکه‌اي متصل به هم و در نتيجه تغيير رنگ مي‌شود. اين تغيير رنگ به‌واسطه خصوصيات پخش، ميان‌کنشِ بين پلاسمون‌هاي سطح ذره و تغيير فاصله بين نانوذرات طلا ايجاد مي‌گردد. اين تغيير رنگ نشان‌دهنده وجود مولکول هدف در نمونه بوده و به روش چشمي هم قابل مشاهده است. اين شبکه متشکل از تجمع نانوذرات به‌وسيله هيبريدشدن پروبهاي نانوذرات طلا با مولکول هدف، در درجه حرارت‌هاي مختلف، باعث ايجاد تغيير رنگ ناگهاني (sharp) مي‌شود که در شکل (1)، نمونه‌اي از آن مشاهده مي‌شود.
با انتقال مخلوطي از مجتمعات ايجاد شده بين DNA تثبيت شده، زنجيره مکمل آن و رشته‌هايي با درجات متفاوتي از تغيير توالي (نسبت به زنجيره مکمل) بر روي TLC در دماهاي مختلف، مي‌توان الگوي استانداردي براي ارزيابي ميزان هيبريد شدن در دماهاي مختلف به دست آورد. با استفاده از اين خصوصيات رنگ و دما مي‌توان به روشي براي تشخيص وجود جهش در DNA هدف موجود در نمونه مورد بررسي، پي برد. به عبارت ديگر از اين روش مي‌توان براي تشخيص SNPs و ديگر mismatchs استفاده کرد. شکل (2) چگونگي استفاده از اين روش را براي تشخيص جهش در DNA هدف، نشان مي‌دهد.
حساسيت تشخيص روشهاي رنگ‌سنجي با احياي نقره (Ag) به وسيله نانوذرات طلا افزايش مي‌يابد. روش روبش‌گري (Scannometry)، يک روش سنجش ساندويچي و شامل رشته DNA متصل به يک بستر
(يا DNA Chip)، يک توالي هدف و يک پروب نانوطلاست. اتصال مولکول‌هاي هدف و پروب نانوطلا به توالي متصل به بستر، يکسري لکه‌هاي خاکستري (gray spot) را ايجاد مي‌کند که ويژه مولکول هدف بوده و غلظت نمونه را نيز نشان مي‌دهد. شدت رنگ اين لکه‌ها با يک روبش‌گر (scanner) و يا حتي چشم غير مسلح، قابل تشخيص است. در صورت استفاده از نقره، با احياي آن روي نانوذرات طلا (شکل 3) ، مي‌توان حساسيت تشخيص را بالا برد. با استفاده از نانوذرات مختلف طلا (و در نتيجه رنگ‌هاي مختلف) تشخيص همزمان چندين مولكول هدف ميسر مي‌گردد. اين روش تشخيص مولکولي چهار برابر ويژگي بالاتر و صد برابرحساسيت بيشتر از روشهاي فلوريمتري رايج دارد.
يک مثال براي اين روش، بارکد زيستي (Bio-barcode) است. بارکد زيستي، يک توالي DNA ساختگي و انتخابي براي يک توالي DNA هدف است که از آن براي تشخيص DNA (شکل 4) يا پروتئين (شکل 5) در نمونه‌هاي بيولوژيک استفاده مي‌شود.
الف) تشخيص DNA
در اين روش ابتدا يک زنجيره DNA با توالي دلخواه (Bar- Code DNA) طراحي و رشته مکمل آن نيز ساخته و پس از فعال شدن، بر روي نانوذرات طلا نشانده مي‌شود. همچنين رشته DNA ديگري که مکمل بخشي از DNA هدف (آنچه قرار است در نمونه شناسايي شود) است، پس از فعال شدن بر روي نانوذره طلا تثبيت مي‌شود. سپس اجازه هيبريد شدن رشته بار -کد با DNA مکمل داده مي‌شود. از طرفي رشته سوم DNA که مکمل بخش ديگري از DNA هدف است، پس از فعال شدن بر روي ذرات مغناطيسي تثبيت مي‌شود. با قرار گرفتن اين دو ذره در محلول، اگر DNA هدف وجود داشته باشد، حتي در مقادير بسيار اندک، موجب اتصال اين دو ذره به يکديگر مي‌شود. در مرحله بعد با توجه به خاصيت مغناطيسي ذره دوم، مي‌توان آنها را از محلول جدا کرد و بعد با استفاده از عواملي (مثل ترکيبات دناتوره‌کننده) که دو رشته DNA را جدا مي‌کنند، DNA بار-کد را از مکمل آن جدا و شناسايي کرد. حتي مي‌توان از ترکيباتي مثل نقره که حساسيت تشخيص را بالا مي‌برند نيز استفاده کرد. به اين ترتيب مقادير بسيار اندک از يک توالي DNA بدون نياز به PCR قابل شناسايي و حتي اندازه‌گيري است.
ب) تشخيص يا اندازه‌گيري پروتئين با استفاده از Bar- Code DNA
در اين روش نيز همانند روش قبل، از يک توالي انتخابي و مکمل آن که بر روي نانوذرات طلا نشانده شده، استفاده مي‌شود. همچنين آنتي بادي پلي کلونال عليه پروتئين مورد اندازه‌گيري بر روي اين ذرات طلا تثبيت مي‌شود. اين آنتي‌بادي‌ها بر روي ذرات مغناطيسي نيز نشانده مي‌شود. حال با وارد کردن اين دو ذره در محلول حاوي پروتئين مورد نظر، پروتئين به آنتي‌بادي موجود در سطح هر دو ذره متصل شده و آنها را به يکديگر متصل مي‌کند. پس از شستشو و حذف ساير مواد، با توجه به خاصيت مغناطيسي ذره دوم، مي‌توان آن را از محلول جدا و همانند روش قبلي، پس از جدا کردن رشته DNA بار-کد از مکمل آن با استفاده از مواد دناتوره‌کننده DNA بار- کد را، که نمادي از حضور پروتئين مورد نظر در نمونه است شناسايي و انداره‌گيري کرد. به اين ترتيب مقادير بسيار اندک پروتئين در نمونه قابل شناسايي است.
آخرين بحث مربوط به بازخواني نوري نانوذرات طلا، ترکيب نانوذرات طلا با رنگ‌هاي رامان است که پخش رامان به وسيله نانوذرات طلا (SERS) را افزايش مي‌دهد و به افزايش سيگنال براي مولکول‌هاي جذب شده در سطوح زبر فلز، به ويژه نقره و طلا مربوط مي‌شود. اين افزايش سيگنال از طريق دو ساز و كار تقويت موضعي ميدان الکترومغناطيسي در الکترون آزاد فلز و اثر شيميايي روي مولکول جذب شده در سطح فلز به‌وسيله نانوذرات طلا صورت مي‌گيرد. محدوده تشخيص، در محدوده طيف رامان بوده و به‌صورت اثر انگشت‌هاي طيف رامان ظاهر مي‌گردند. رنگ‌هاي رامان به‌دليل باندهاي جذبي باريک، تهييج از سوي ليزر و محدوده طيف رامان، قادر به افزايش سيگنال تشخيص در محدوده طيف‌هاي رامان مي‌گردند. با اين روش محدوديت لکه‌هاي خاکستري حاصل از روش روبشي(Scanometric) بر طرف شده، استفاده همزمان از چندين رنگ رامان در تشخيص چند مولکول امكان‌پذير مي‌گردد. شکل (6) چگونگي کاربرد اين روش را با استفاده از نانوذرات طلا نشان مي‌دهد.
نانوذرات طلا همچنين به عنوان داربست (Scafold) و فرونشاننده‌هاي quenchers نشر فلورسانس در تشخيص همگن اسيدهاي نوکلئيک عمل مي‌کنند [1]. همان‌طور که در شکل (7) ملاحظه مي‌شود، قطعات اليگونوکلئوتيد به يک ترکيب داراي نشر فلورسانس (فلوروفور) متصل مي‌شوند. سپس اين رشته‌ها به نانوذرات طلا متصل مي‌گردند، به طوري که به‌صورت تک‌زنجيره به ذره طلا نزديک شده و نشر نداشته‌باشند. پس از اينکه اين ذره در محلول حاوي DNA هدف قرار گرفت، در صورت تشکيل هيبريد، دو ماده فلوروفور از يکديگر فاصله گرفته، نشر فلورسانس قابل مشاهده و آناليز مي‌شود.
2-2. تشخيص الکتريکي مولکول‌هاي زيستي با استفاده از نانوذرات طلا
يکي از روشهاي ساده شناسايي DNA هدف، تشخيص الکتريکي است (شکل (8) سمت راست) . در اين روش پروبهاي DNA روي صفحاتي با اندازه ميکرون (chip) در بين دو الکترود، تثبيت مي‌گردد. اين پروب‌ها طوري طراحي مي‌شود که مکمل نيمي از DNA هدف باشد. همچنين طراحي پروبهاي نانوطلا به گونه‌اي است که اليگونوکلئوتيد آن مکمل نيمي ديگر از DNA هدف باشد. هيبريد شدن DNA هدف با پروبهاي نانوطلا و پروب تثبيت‌شده بر روي سطح، باعث مي‌شود که نانوذرات طلا در حدفاصل بين دو الکترود قرار گيرند. با افزودن نقره، کمپلکس تشکيل شده بين دو الکترود، فلز نقره را به داخل کشيده و پلي بين دو الکترود ايجاد مي‌شود. از تغيير جريان حاصل مي‌توان براي تشخيص حضور DNA هدف، استفاده كرد. دقت اين روش در حد 500 فمتو است و از آن در سنجش‌هاي ايمني نيز استفاده مي‌گردد.
2-3. تشخيص مولکول‌هاي زيستي با استفاده از خواص الکتروشيميايي نانوذرات طلا
خاصيت احياکنندگي نانوذرات طلا باعث شده است که از آنها به عنوان نشان‌هاي الکتروشيميايي در تشخيص اسيد نوکلئيک استفاده گردد. هيبريد شدن DNA هدف روي الکترود تثبيت شده با پروبهاي نانوطلا يک موج اکسايش طلا در حدود 27/1 ولت ايجاد مي‌كند. تشخيص حضور يک جهش منفرد يا پلي‌مورفيسم تک بازي (SNP)، همچنين شناسايي بازهاي درگير، با استفاده از نوکلئوتيدهاي نشاندار با نانوذرات طلا امکان‌پذير مي‌گردد [1 و 5]. چگونگي انجام اين روش در شکل (8)- سمت چپ، نشان داده شده است. همان‌گونه که ملاحظه مي‌شود، ابتدا اليگونوکلئوتيد مکمل با DNA هدف بر سطح الکترود تثبيت مي‌شود. آن‌گاه محلول بيولوژيک حاوي DNA هدف به آن اضافه و هيبريد تشکيل مي‌شود. اگر نمونه حاوي DNA داراي حتي يک جهش نيز باشد، چون تشکيل پيوند هيدروژني در آن ناحيه صورت نمي‌گيرد، در ناحيه جهش، باز (ها) آزاد است. حال ، نانوذرات طلاي متصل به تک تک نوکلئوتيدها، مرحله به مرحله به اين نمونه ، افزوده مي‌شود. در صورت اتصال نوکلئوتيد متصل به نانوذره طلا به باز مکمل (که نشانگر وجود جهش در DNA هدف است) ، موج اکسايش طلا به طريق الکتروشيميايي قابل مشاهده و اندازه‌گيري است.
برهنه‌سازي الکتروشيميايي (Stripping voltametry)
يک پروتکل اندازه‌گيري الکتروشيميايي حساس است که در اندازه گيري آثار عناصر فلزي در مايعات زيستي (خون، ادرار، بزاق)، بافت‌ها (دندان و مو)، فراورده‌هاي غذايي (نوشابه‌ها وآب) و نمونه‌هاي زيستي (آب دريا و رودها) کاربرد دارد. آناليزهاي بر پايه برهنه‌سازي الکتروشيميايي از دو مرحله پيش‌تغليظ، سپس برهنه‌سازي تشکيل شده است. در مرحله پيش‌تغليظ، نمونه محلول در حجم کوچکي از الکترود قرار مي گيرد که در حقيقت براي بررسي محلول‌هاي tracer به کار مي‌رود. در محلول پيش‌تغليظ Electrodeposition انجام مي‌شود که آناليت با انجام واکنش از محلول به داخل الکترود تغليظ مي‌شود و پس از اين مرحله، مرحله برهنه‌سازي با استفاده از روش ولتامتري انجام مي‌شود که طي آن آناليت تغليظ شده با انجام واکنش عکس مجدداً حل و اندازه‌گيري مي‌شود. به‌دليل تغليظ نمونه با فاکتور صد تا هزار برابر در الکترود، جريان اندازه‌گيري شده کمتر تحت تأثير جريان خازني يا جريان باقي‌مانده ناخالصي قرار مي‌گيرد. تقويت سيگنال، با استفاده از سوارکردن چندين نانوذره طلا، سپس نانوذرات نقره بر روي يک بستر پليمري به دست مي‌آيد. نانوذرات بعداً مي‌توانند به طور آنزيمي حل و به‌وسيله برهنه‌سازي الکتروشيميايي اندازه‌گيري شوند. از اين روش در تشخيص پروتئين و DNA استفاده مي‌گردد. شکل (9) تشخيص آنتي‌ژن با استفاده از روش برهنه‌سازي الکتروشيميايي را نشان مي‌دهد. در اين شکل ابتدا يک آنتي‌بادي پيگردي روي يک ذره مغناطيسي قرار مي‌گيرد که به آنتي‌ژن هدف مي‌چسبد. آنتي بادي تشخيصي که روي نانوذره طلا سوار شده است اضافه مي‌شود، سپس نانوذره نقره افزوده مي‌شود. نانوذره طلا باعث احياي نانوذره نقره مي‌گردد. کمپلکس نانوذرات و Ag-Ab روي يک مگنت قرار گرفته و نانوذرات روي الکترودها تغليظ مي‌شوند. با اعمال پتانسيل، نانوذرات رسوب‌کرده جدا شده و به روش برهنه‌سازي الکتروشيميايي تشخيص و اندازه‌گيري مي‌شوند که تغيير جريان با غلظت نمونه برابر است.
3. نقاط يا ذرات کوانتومي
نانوکريستال‌هاي مواد نيمه‌رسانا از قبيل سلنيد و کادميم، نانوابزار ديگري براي تشخيص آزمايشگاهي محسوب مي‌شود. اين کريستال‌هاي نيمه‌رسانا به عنوان منابع نور مولکولي عمل مي‌کنند و خصوصيات آنها به اندازه و شکل شان وابسته است. به محض اتصال يک آنتي‌بادي يا ديگر مواد تثبيت‌شده روي ذرات کوانتومي به مولکول هدف مورد نظر، نقاط کوانتومي شبيه beacon در اثر عمل اتصال، نور ساطع مي‌کنند. امروزه ذرات کوانتومي به دلايلي از قبيل نشر وابسته به اندازه ذره، درخشان‌تر بودن، تجزيه نشدن در برابر نور، تهييج همزمان چندين رنگ، تهييج ساده و حساسيت بالا مورد توجه قرار گرفته‌اند.
3-1. توليد پروبهاي نقاط کوانتومي
سنتز: اين نقاط يا ذرات عمدتاً از صدها تا هزاران اتم عناصر گروه دو و شش جدول تناوبي (مثل CdTe وCdSe) و يا عناصر گروه سه و پنج (مثل InP و InAs) به‌صورت دوفازي يا سه‌فازي تهيه مي‌گردند که اين سيستم دوعنصري موجب ايجاد حالت نيمه‌رسانايي اين ترکيبات مي‌شود. ذرات کوانتومي از يک هسته (core) نيمه‌رساناي فلورسانس (مثل CdSe، CdTe، InP و يا InAs) و يک پوسته ظريف از يک ماده با باند انرژي بيشتر (مثل CdS، ZnS و يا ZnSe) تشکيل شده‌اند. اين پوسته باعث پايداري هسته در برابر نور شده، از خاموشي سطحي تهييجات جلوگيري مي‌کند و در نتيجه بازدهي کوانتوم را افزايش مي‌دهد [10 و 11]. حلال‌هاي آلي از قبيل تري- ان- اكتيل فسفين (TOPO ) و هيدروکسيل آمين جهت حفظ خصوصيات نوري ذرات کوانتومي و محافظت هسته از محيط اطراف به عنوان پوشش (cap) به کار مي‌روند. ترکيباتي مثل پلي‌اتيلن گليکول (PEG) يا گروه‌هاي کربوکسيلات باعث حل‌شوندگي اين ترکيبات مي‌گردند. مرحله آخر توليد اين ذرات، مزدوج کردن (کنژوگاسيون) آنها به ليگاندهاي بيولوژيک از قبيل پپتيدها و اوليگونوکلئوتيدها براي اتصال به ترکيبات هدف است که اين کنژوگاسيون مي‌تواند به اشکال مختلف از جمله اتصال کوالاني، اتصال قطعه آنتي‌بادي به ذرات کوانتومي از طريق آمين سولفيدريل، کنژوگاسيون آنتي‌بادي‌ها به ذرات کوانتومي از طريق پروتئين آداپتور و اتصال پپتيدهاي منتهي به هيستيدين و پروتئين‌ها به ذرات کوانتومي حاوي Ni-NTA باشد. شکل (10) ساختمان پروب ذرات کوانتومي و شکل (11) روشهاي مختلف کنژوگاسيون ذرات کوانتومي را نشان مي‌دهد.
لازم به توضيح است که ذرات کوانتومي زماني نور را جذب مي‌کنند که انرژي برانگيختن بيشتر ازانرژي Bandgap باشد. در طول اين فرايند الکترون‌ها از لايه ظرفيت به لايه هدايت منتقل مي‌شوند. نشر وابسته به ذرات کوانتومي به شيوه on-off عمل مي‌کند که وابسته به قدرت برانگيختگي است و اين پديده احتمالاً از فوتويونيزاسيون و خنثي شدن بار نانوکريستال‌ها ناشي مي‌شود.
نانوذرات کوانتومي به دلايل مذكور کاربردهاي وسيعي پيدا کرده‌اند که از جمله اين کاربردها مي‌توان به موارد زير اشاره کرد[3]: Immunohistochemistry، تشخيص و تعيين ژنومي، تشخيص مارکرهاي زيستي، تشخيص اوليه سرطان، تشخيص ميکروارگانيسم‌هاي عفوني مثل مالاريا و HIV، سنجش‌هاي خون کامل، تشخيص حساس RNA ويروسي در حد صد کپي، سنجش‌هاي ايمني و تصويرسازي از بافت زنده و... .
3-2. تشخيص نوري مولکول‌ها به سيله ذرات کوانتومي
ذرات کوانتومي به‌دليل داشتن ضريب جذب مولي بالا بسيار درخشان‌تر از ساير مولکول‌هاي فلوروفور هستند، همچنين به‌دليل داشتن پايداري بيشتر در مقابل نور، طيف جذبي وسيع و نشري باريک، کانديداي خوبي جهت تشخيص مولکول‌ها در شرايط in vivo محسوب مي‌شوند. از اين خصوصيات نوري ذرات کوانتومي در شرايط in vivo براي تشخيص گيرنده‌هاي سطح سلولي، اجزاي اسکلت سلولي و آنتي‌ژن‌هاي هسته‌اي در نمونه‌هاي مختلف شامل سلول‌هاي زنده، سلول‌هاي تثبيت‌شده و برش‌هاي بافتي استفاده مي‌شود[1و3 و10و11و12]. شکل (12) تشخيص همزمان چندين مولکول هدف را به وسيله ذرات کوانتومي با اندازه‌هاي مختلف و در نتيجه با رنگ‌هاي مختلف و فلورسنت نشان مي‌دهد.
3-3.تشخيص مولکولي بر پايه خصوصيات الکتروشيميايي ذرات کوانتومي
ذرات کوانتومي داراي خصوصيات احياکنندگي هستند. از ذرات کوانتومي با پتانسيل‌هاي اکسيداسيون مختلف جهت تشخيص همزمان چندين مولکول هدف استفاده مي‌گردد (شکل (13)).
4. نانوذرات مغناطيسي
پروبهاي نانوذرات مغناطيسي يک کلاس جديد از عوامل کنتراست و پيگردي (tracking) جهت تصويرسازي پزشکي هستند. ساختمان اين ذرات شامل يک هسته (حاوي ترکيباتي مثل اكسيد آهن اَبَرپارامغناطيس (SPIO)، نيکل و يا کبالت) بوده که امروزه بيشتر از SPIOs به‌دليل نداشتن خاصيت سمي استفاده مي‌شود. در ساختمان اين نانوذرات پوششي (coating) از دکستران يا پلي اتيلن گليکول نيز وجود دارد که از تجمع (aggregation) اين نانوذرات جلوگيري و باعث حل شوندگي آنها در آب و آماده شدنشان براي کونژوگه شدن مي‌شود. نانوذرات با SPIOs، بنا به دلايلي از جمله غير سمي بودن، نداشتن خاصيت ايمني، اندازه کوچک، خاصيت مغناطيسي بالا، قابليت تنظيم براي ارگان‌هاي هدف ويژه با تغيير در اندازه، ضخامت پوسته، شيمي سطحي و ليگاند هدف بيشتر استفاده مي‌شوند. در کاربردهاي in vivo نانوذرات آهن اکسيد مگميت و مگنيت به عنوان عوامل کنتراست در تصويرسازي‌هاي MRI و NMR استفاده مي‌شود اين ترکيبات تصوير حاصل از MRI و NMR بافت هدف را در نتيجه به هم زدنRelaxation Time آب اطراف تيره‌تر از ساير قسمت‌ها مي‌کنند و در شرايط in vivo بافت‌هايي مثل کبد، طحال، مغز استخوان و گره‌هاي لنفاوي که حاوي ماکروفاژ بيشتري هستند عوامل کنتراست مغناطيسي را بيشتر به دام مي‌اندازند و از اين خاصيت در داخل بدن براي پيگيري بيماري‌هاي اين اعضا، به‌خصوص موارد التهابي به‌صورت فرايندهاي فيزيولوژيک استفاده مي‌کنند. چون در بافت‌هاي سرطاني، اين فرايندهاي فيزيولوژيک ماکروفاژها را جذب نمي‌کنند پس در NMR رنگ درخشانتري را نشان مي‌دهند. به منظور افزايش ويژگي پروبهاي نانوذرات مغناطيسي به بافت هدف، ليگاندهاي خاص مولکول يا بافت هدف همراه با يکسري عوامل در سطحشان که به آنها اجازه عبور از سلولها را مي‌دهند طراحي مي‌گردند. شکل (14) تصويري از پروب SPIOs را جهت تصويرسازي ويژه به وسيله MRI نشان مي‌دهد. از نانوذرات مغناطيسي در ايمنواسي‌ها نيز استفاده مي‌شود.
Magnetorelaxometry، روشي است براي سنجش که ويسکوزيسته مغناطيسي يا Relaxation حرکت مغناطيسي يک سيستم نانوذره مغناطيسي را پس از خاموش کردن ميدان مغناطيسي اندازه‌گيري مي‌کند. در اين سنجش‌ها آنتي‌ژن‌هاي هدف در سوسپانسيوني از آنتي‌بادي نشاندار با مگنت مخلوط مي‌گردند و با اعمال يک ميدان مغناطيسي، ذرات نانو خاصيت مغناطيسي خالص پيدا کرده که با خاموش کردن ميدان مغناطيسي،Relaxation پيدا مي‌کنند. تشخيص اتصال پروب به مولکول هدف با استفاده از تمايز فرايندهايRelaxation به دست مي‌آيد؛ نانوذرات غير متصل سريعاً چرخش براوني ( Brawnian) پيدا مي‌کنند، در حالي که نانوذرات متصل به مولکول هدف به آهستگي دچار Relaxation Neel شده و يک حرکت مغناطيسي ايجاد مي‌نمايند که آشکارساز (Dtector) آن را ثبت مي‌گردد. اين روش علاوه بر امكان‌پذير ساختن توانايي تشخيص و تمايز نشانگرهاي متصل و غير متصل به مولکول هدف نياز به جداسازي نمونه را نيز بر طرف ساخته و در نتيجه اجازه تشخيص همگن ماده را مي‌دهد.
5. نانوذرات سيليکا
نانو ذرات سيليکا؛ ذرات رنگي در اندازه‌هاي دو تا 200 نانومتر هستند و ساختمانشان از تشكيل تعداد زيادي مولکول‌هاي رنگي در داخل يک ماتريکس سيليکا است. سيگنال فلورسانس اين ذرات ده هزار بار قوي‌تر از فلوروفورهاي معدني است و به خاطر نشر و درخشندگي زيادي كه دارند کانديداي خوبي براي آناليزهاي حساس به شمار مي‌روند؛ به طوري‌که نياز به آمپلي فيکاسيون قبلي نمونه را بر طرف مي کنند. نانوذرات سيليکا علاوه برآناليزهاي حساس، در تصويرسازي مولکولي و تشخيص همزمان چندين مولکول هدف با استفاده از مولکول‌هاي رنگي با اندازه‌هاي مختلف (و در نتيجه رنگ‌هاي مختلف) كاربرد دارند. پايداري و چگالي بالاي سيليکا ، جداسازي سانتريفوژي، تغييرات سطحي و ديگر فرايندهاي آناليز را راحت‌تر کرده است. از مزاياي ديگر اين ذرات، هيدروفوبيک بودن ساختمان آنهاست که باعث محافظت از حمله‌هاي ميکروبي، تورم و يا تغيير منافذ آنها در اثر تغيير pH مي شود. از خاصيت فلورسنتي بالاي نانوسيليکا براي تشخيص ميکروارگانيسم‌ها و همچنين DNA و پروتئين در زمان سريع با حساسيت بالا استفاده مي‌گردد. اين ذرات به‌دليل داشتن مولکول‌هاي رنگي بيشتر در داخل ماتريکس سيليکا، سيگنال هيبريد خيلي قوي نسبت به نانوذرات قبلي مورد اشاره شده ايجاد مي‌کنند.
با استفاده از انواع مختلف رنگ‌هاي داخل ماتريکس كه داراي غلظت‌هاي مختلف هستند، مي‌توان نانوذرات بارکدينگ Substrate) -Barcoding) ايجاد کرد که مشخصات نوري ويژه‌اي دارند، اين نانوذرات قادر به شناسايي همزمان چندين مولکول زيستي را روي سطح سلول هدف هستند.
در شکل (15) از سيستم دورنگي استفاده گرديده‌است نانوذرات و آنتي‌بادي كه با نسبت‌هاي مختلفي كه دارند، به طور ويژه ميکروسفرهاي پوشيده با آنتي بادي ثانويه مربوطه را تشخيص مي‌دهند، در نتيجه به طور همزمان فرايندهاي تشخيص بين نانوذرات گنژوگه و مولکول‌هاي هدف مربوطه روي سطح سلول انجام مي‌شود. وقتي که مخلوط نانوذرات- سلول از يک فلوسايتومتر عبور داده مي‌شود هر کمپلکس نانوذرات- سلول فلورسانس ويژه‌اي را ايجاد مي‌کند که مشخصه نانوذرات متصل شده و در نتيجه نمونه به خصوصي در ايجاد يک موجي ويژه محسوب مي‌شود. از نانوذرات سيليکا به‌دليل داشتن خاصيت احياکنندگي زيادشان به عنوان نشان‌هاي الکتروشيميايي نيز استفاده مي‌شود.
6. نتيجه‌گيري
1. ذرات نانو به عنوان Labels يا Tags، حساسيت، سرعت و انعطاف‌پذيري تست‌هاي بيولوژيکي که حضور يا فعاليت مواد مورد نظر را اندازه مي‌گيرند افزايش مي‌دهد.
2. نانوذرات قادر به آزمايش نمونه‌هاي در حجم کم هستند.
3. از بسياري از روشهاي توصيف شده مي‌توان براي DNA و پروتئين‌ها استفاده كرد.
4. نانوذرات امکان تشخيص ميکروارگانيسم‌ها يا مولکول‌هايي که به وسيله روشهاي رايج امکان‌پذير نيست فراهم مي‌سازند.
5. تشخيص اوليه بيماري‌هايي از قبيل سرطان، بهبود و موفقيت درمان را بيشتر مي‌کند.
6. برخي از روشهاي اشاره شده نياز نمونه به PCR را برطرف مي‌کنند.
7. نانوذرات با کاهش زمان مورد نياز براي تست نمونه يک اثر مثبت روي تصميم‌گيري‌هاي باليني و هزينه‌هاي درمان دارند.
8. پروبهاي نانوذرات امکان کاربري در تشخيص‌هاي in vivo را به‌خوبي دارا هستند.
9. اکثر اين ترکيبات غير سمي يا سميتشان خيلي پايين است.
منابع
1-Natalia, C. T. and Zhiqiang, G. (2006) “Nanoparticles in biomolecular detection” Nanotoday ; 1 (1) : 28-37
2-Salata, O. V. (2004) “Application of nanoparticles in biology and medicine” J. Nanobiotechnology; 2 (3) : 1-8
3-Kewal, K. and Jain, T. (2005) ” Nanotechnology in clinical laboratory diagnostics” Clinica Chimica Acta; 358: 37–54
4-Paolo, F. , Larry, J. and Saul, S. (2005) “Nanobiotechnology: the promise and reality of new approaches to molecular recognition” Trends in biotechnology ; 23 (4) : 169-173
5- Shad, C. and Mirkin, C. A. (2005) “DNA-Gold-Nanoparticles Conjugates” In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) ,WILEY-VCH. pp. 289-307
6- Shad, T. C. , Dimitra, G. and Mirkin, C. A. (2005) “Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acid targets” Clinica Chimica Acta. xx (2005) *** – ***
7-Jwa, M. N. , Shad, C. and Chad, C. M. (2003) “Nanoparticle-Based Bio-barcodes for the Ultrasensitive Detecetion of proteins” Science ; 301: 1884-1886
8- Jwa, M. N. , Savka. I. S. and Chad A. M (2004) “Bio-Bar-Code-Based DNA Detection with PCR-like Sensitivity” J. Am. Chem. Soc ; 126 (19) : 5932 -3
9-Park,S. J. and Chad, C. M. (2002) “Array-Based Electrical Detection of DNA with Nanoparticle probes” Science ; 295: 15031506
10- Xiaohu, G. , Yang, L. , John A P. and Marshall, F. (2005) “In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots” Current |Opinion in Biotechnology ;16: 63-72
11- Xiaoho,G. and Shuming,N. (2005) “Luminescent Quantum Dots for biological Labeling” In: Nanobiotechnology: Concepts,Application and perspectives. (Niemeyer, C. M. and Mirkin, C. A.) , WILEY-VCH. pp. 343-341
12-Wu X, L. H. , and Liu, J. (2003) “Immunofluorescent labeling of
cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor
quantum dots” Nat. Biotechnol. ;21: 41– 6.
13-Pedro,T. , Maria, D. and Morale, P. (2003) “The preparation of magnetic nanoparticles for application in biomedicine” J. Phys. Appl. Phys;36: R182-R197
14- Conte,L. , Nitin ,N. and Gang, B. (2005) “ Magnetic nanoparticle probes” Nanotoday ;may 2005: 32-38
15-E. Romanus, M. , Hückel, C. and Weitschies, R. (2003) “Magnetic nanoparticle relaxation measurement as a binding specific technique for in vivo diagnostics” file: //F: \nnn\Nanoparticle Symposium May 2003- Abstracts.
16- Wang,L. , Kemin, W. , Swadeshmukul, S. ,Xiaojun, Z. Yanrong, W. (2006) “Watching Silica Nanoparticles” Anal. Chem ;February 1: 646-654
17- Zhao, X. , Lisa R. Hilliard*, Mechery,S. J. , Wang ,Y. ,Rahul, P. and Jin, Sh. (2004) “ A rapid bioassay for single bacterial cell quantitation
using bioconjugated nanoparticles” PNAS;101 (42) : 15027-15032etic
http://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-1_resize.JPGشکل1. خصوصيات نوري نانوذرات طلاي جدا از هم و مجتمعhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-2_resize.JPGشکل2. تشخيص SNPs با استفاده از پروبهاي نانوطلا-DNAhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-3_resize.JPGشکل3. سنجش DNA به روش روبش‌گري(Scannometry) http://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-4.JPGشکل4. تشخيص DNA بر پايه Bio-Barcodehttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-5_resize.JPGشکل 5. تشخيص پروتئين (PSA) در مايع مغزي– نخاعي، بر پايه Bio-Barcodehttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-6_resize.JPGشکل6. تشخيص همزمان چند مولکول با استفاده از چند رنگ رامان و نانوذرات طلاhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-7_resize.JPGشکل7. تشخيص نوري مولکول‌ها با نانوذرات طلا به عنوان فرونشاننده‌هاي نشر فلورسانسhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-8.JPGhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-8-2.JPGشکل8. (سمت راست) تشخيص الکتريکي هيبريد شدن DNA و سمت چپ شناسايي الکتروشيميايي پلي‌مورفيسم تک بازي (SNP) با استفاده از نانوذرات طلاhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-9_resize.JPGشکل9. تشخيص يک آنتي‌ژن به روش برهنه‌سازي الکتروشيميايي با استفاده از نانوذرات طلاhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-10_resize.JPGشکل 10. ساختمان پروپ نانوذرات کوانتوميhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-11.JPGشکل11. روشهاي مختلف کنژوگاسيون ذرات کوانتوميhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-12_resize.JPGشکل12. تشخيص کمپلکس آنتي‌بادي‌ها با استفاده از ذزات کوانتوميhttp://www.nano.ir/images/newsletter/n114/3528-13.JPGشکل13. تشخيص الکتروشيميايي چندين مولکول هدف با استفاده از نانوذرات کوانتومي